Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione
Summary
La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.
Abstract
La disfunzione mitocondriale nei nervi periferici accompagna diverse malattie associate alla neuropatia periferica, che può essere innescata da molteplici cause, tra cui malattie autoimmuni, diabete, infezioni, disturbi ereditari e tumori. Valutare la funzione mitocondriale nei nervi periferici del topo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni del campione, di un numero limitato di mitocondri presenti nel tessuto e della presenza di una guaina mielinica. La tecnica descritta in questo lavoro minimizza queste sfide utilizzando un protocollo di permeabilizzazione unico adattato da quello utilizzato per le fibre muscolari, per valutare la funzione mitocondriale del nervo sciatico invece di isolare i mitocondri dal tessuto. Misurando la produzione di specie reattive fluorimetriche con Amplex Red/Peroxidase e confrontando diversi substrati e inibitori mitocondriali nei nervi permeabilizzati alla saponina, è stato possibile rilevare contemporaneamente gli stati respiratori mitocondriali, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e l’attività dei complessi mitocondriali. Pertanto, il metodo qui presentato offre vantaggi rispetto alla valutazione della funzione mitocondriale con altre tecniche.
Introduction
I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l’apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all’importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi 1,2,3. La rete dinamica della membrana mitocondriale è controllata da processi di fusione e fissione e dispone anche di macchinari per il controllo di qualità e mitofagia 4,5,6.
La disfunzione mitocondriale è associata alla comparsa di diverse condizioni patologiche come il cancro, il diabete e l’obesità7. Disturbi della funzione mitocondriale sono rilevati nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale, come nel morbo di Alzheimer 8,9, nel morbo di Parkinson10,11, nella sclerosi laterale amiotrofica12,13 e nella malattia di Huntington 14,15 . Nel sistema nervoso periferico, la perdita della funzione mitocondriale negli assoni è osservata nelle neuropatie immunitarie, come la sindrome di Guillain-Barré16,17, e in associazione con un’elevata produzione di ROS mitocondriale negli assoni, questi eventi portano all’attivazione della MAP Chinasi nelle cellule di Schwann18. Ciò dimostra che la fisiologia mitocondriale può essere essenziale non solo per una cellula sito-specifica, ma per un intero tessuto. Nella polineuropatia sensoriale distale associata all’HIV (HIV-DSP), i mitocondri hanno un ruolo nel meccanismo attraverso il quale il trans-attivatore della proteina di trascrizione (HIV-TAT) consente all’HIV di replicarsi in modo efficiente, così come molti altri ruoli nella patogenesi dell’infezione da HIV19,20.
La valutazione della fisiologia mitocondriale del nervo sciatico è emersa come un obiettivo essenziale per lo studio della neuropatia 7,21,22. Nella neuropatia diabetica, le analisi proteomiche e metabolomiche suggeriscono che la maggior parte delle alterazioni molecolari nel diabete influenzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale del nervo sciatico e il metabolismo lipidico7. Queste alterazioni sembrano anche essere i primi segni del diabete21 indotto dall’obesità. In un modello murino di neuropatia dolorosa indotta dalla chemioterapia, la compromissione mitocondriale nel nervo sciatico viene rilevata come una diminuzione della fosforilazione ossidativa22 e una riduzione delle attività dei complessi mitocondriali, del potenziale di membrana e del contenuto di ATP23. Tuttavia, sebbene diversi gruppi abbiano citato la disfunzione mitocondriale nelle neuropatie, questi studi sono limitati alle misurazioni dell’attività nei complessi mitocondriali senza conservazione delle membrane mitocondriali, mancando la valutazione dell’integrità mitocondriale o le misurazioni del contenuto di ATP come parametro per la produzione di ATP mitocondriale. In generale, una corretta valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale e della produzione di ROS richiede l’isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione differenziale in un gradiente percoll/saccarosio. L’isolamento dei mitocondri può anche essere un fattore limitante per il tessuto nervoso sciatico a causa della grande quantità di tessuto necessario e della perdita e interruzione dei mitocondri.
Il presente studio mira a fornire un protocollo per misurare la fisiologia mitocondriale come il consumo di ossigeno mitocondriale e la produzione di ROS nel nervo sciatico, preservando le membrane mitocondriali e senza la necessità di isolare i mitocondri. Questo protocollo è adattato dalle misurazioni del consumo di ossigeno nelle fibre muscolari permeabilizzate24 mediante respirometria ad alta risoluzione (HRR). I vantaggi di questa procedura sono la possibilità di valutare i mitocondri in piccole quantità di tessuto come il nervo sciatico e valutare i parametri mitocondriali in situ, preservando così l’ambiente mitocondriale, la struttura e il profilo bioenergetico, per ottenere un risultato fisiologicamente affidabile. Gli stati respiratori mitocondriali sono stati determinati con substrati e inibitori dopo permeabilizzazione del nervo sciatico per valutare correttamente la bioenergetica mitocondriale e il coefficiente del citocromo c per l’integrità della membrana mitocondriale, fornendo una guida per le fasi della valutazione del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETS) e il calcolo dei parametri essenziali. Questo studio può fornire strumenti per rispondere a domande sui meccanismi fisiopatologici in cui è implicato il metabolismo del nervo sciatico, come le neuropatie periferiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverse malattie o condizioni che accompagnano le neuropatie hanno la disfunzione mitocondriale come fattore di rischio. La valutazione della funzione mitocondriale nei nervi periferici è essenziale per chiarire come agiscono i mitocondri in queste condizioni neurodegenerative. La valutazione della funzione mitocondriale è laboriosa a causa della difficoltà del metodo di isolamento e della scarsità di materiale. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di permeabilizzazione dei tessuti che non richiedono l’isolamento dei mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato da Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Siamo grati al Dr. Antonio Galina Filho, alla Dr. Monica Montero Lomeli e al Dr. Claudio Masuda per il supporto con le strutture di laboratorio, e alla Dr. Martha Sorenson per i commenti gentili e preziosi nel migliorare l’articolo.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
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