Høyoppløselig respirometri koblet til fluorescenssensorer bestemmer mitokondrie oksygenforbruk og reaktiv oksygenart (ROS) generasjon. Den nåværende protokollen beskriver en teknikk for å vurdere mitokondrie respiratoriske rater og ROS-produksjon i permeabilisert isjiasnerve.
Mitokondrie dysfunksjon i perifere nerver følger med flere sykdommer forbundet med perifer nevropati, som kan utløses av flere årsaker, inkludert autoimmune sykdommer, diabetes, infeksjoner, arvelige lidelser og svulster. Vurdering av mitokondriefunksjon i mus perifere nerver kan være utfordrende på grunn av den lille prøvestørrelsen, et begrenset antall mitokondrier tilstede i vevet, og tilstedeværelsen av en myelinhylse. Teknikken beskrevet i dette arbeidet minimerer disse utfordringene ved å bruke en unik permeabiliseringsprotokoll tilpasset en som brukes til muskelfibre, for å vurdere isjiasnerve mitokondriefunksjon i stedet for å isolere mitokondriene fra vevet. Ved å måle fluorimetrisk reaktiv artsproduksjon med Amplex Red/Peroxidase og sammenligne forskjellige mitokondrie-substrater og hemmere i saponin-permeabiliserte nerver, var det mulig å oppdage mitokondrie-respiratoriske tilstander, reaktive oksygenarter (ROS) og aktiviteten til mitokondriekomplekser samtidig. Derfor gir metoden som presenteres her fordeler sammenlignet med vurderingen av mitokondriefunksjon ved andre teknikker.
Mitokondrier er avgjørende for å opprettholde celle levedyktighet og utføre mange cellefunksjoner som energimetabolisme (glukose, aminosyre, lipid og nukleotid metabolisme veier). Som det primære stedet for reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon, er mitokondrier sentrale i flere cellesignaleringsprosesser som apoptose og deltar i syntesen av jern-svovel (Fe-S) klynger, mitokondrieprotein import og modning, og vedlikehold av deres genom og ribosomer 1,2,3. Det mitokondriemembrandynamikknettverket styres av fusjons- og fisjonsprosesser, og de har også maskiner for kvalitetskontroll og mitophagy 4,5,6.
Mitokondrie dysfunksjon er forbundet med utseendet av flere patologiske tilstander som kreft, diabetes og fedme7. Forstyrrelser i mitokondriefunksjonen oppdages i nevrodegenerative lidelser som påvirker sentralnervesystemet, som ved Alzheimers sykdom 8,9, Parkinsons sykdom 10,11, amyotrofisk lateral sklerose12,13 og Huntington sykdom14,15 . I det perifere nervesystemet observeres tap av mitokondriefunksjon i axoner i immun nevropatier, som Guillain-Barré syndrom16,17, og i forbindelse med høy mitokondrie ROS-produksjon i axoner, fører disse hendelsene til MAP Kinase-aktivering i Schwann-cellene18. Dette viser at mitokondriefysiologi kan være viktig, ikke bare for en stedsspesifikk celle, men for et helt vev. I HIV-assosiert distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en rolle i mekanismen der transaktivatoren for transkripsjon (HIV-TAT) protein gjør det mulig for HIV å replikere effektivt, samt flere andre roller i HIV-infeksjonspatogenese19,20.
Evaluering av isjias nerve mitokondrie fysiologi har dukket opp som et viktig mål for å undersøke nevropati 7,21,22. I diabetisk nevropati tyder proteomiske og metabolomiske analyser på at de fleste molekylære endringer i diabetes påvirker isjiasnerven mitokondrie oksidativ fosforylering og lipidmetabolisme7. Disse endringene synes også å være tidlige tegn på fedme-indusert diabetes21. I en musemodell av kjemoterapiindusert smertefull nevropati oppdages mitokondriehemming i isjiasnerven som en reduksjon i oksidativ fosforylering22, og en reduksjon av mitokondriekomplekser aktiviteter, membranpotensial og ATP-innhold23. Men selv om flere grupper har sitert mitokondriedysfunksjon i nevropatier, er disse studiene begrenset til målinger av aktivitet i mitokondriekomplekser uten bevaring av mitokondriemembranene, uten evaluering av mitokondrieintegritet eller målinger av ATP-innhold som en parameter for mitokondrie-ATP-produksjon. Generelt krever en riktig vurdering av mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon isolering av mitokondrier ved differensial sentrifugering i en percoll / sukrose gradient. Isolering av mitokondrier kan også være en begrensende faktor for isjiasnervevev på grunn av den store mengden vev som trengs og mitokondrier tap og forstyrrelser.
Den nåværende studien tar sikte på å gi en protokoll for å måle mitokondriefysiologi som mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon i isjiasnerven, bevare mitokondriemembraner og uten behov for å isolere mitokondrier. Denne protokollen er tilpasset fra oksygenforbruksmålinger i permeabiliserte muskelfibre24 ved høyoppløselig respirometri (HRR). Fordelene ved denne prosedyren er muligheten for å evaluere mitokondrier i små mengder vev som isjiasnerven og evaluere mitokondrieparametere in situ, og dermed bevare mitokondriemiljøet, strukturen og bioenergetisk profil, for å oppnå et fysiologisk pålitelig resultat. Mitokondrie-luftveiene ble bestemt med substrater og hemmere etter isjiasnervens permeabilisering for å vurdere mitokondriebioenergetikk og cytokrom c koeffisient for mitokondriemembranintegritet på riktig måte, og gir en guide for trinn i mitokondrie-elektrontransportsystemet (ETS) evaluering og beregning av essensielle parametere. Denne studien kan gi verktøy for å svare på spørsmål i patofysiologiske mekanismer der isjias nervemetabolisme er implisert, for eksempel perifere nevropatier.
Flere sykdommer eller tilstander som følger med nevropatier har mitokondrie dysfunksjon som en risikofaktor. Evalueringen av mitokondriefunksjon i perifere nerver er avgjørende for å belyse hvordan mitokondriene virker under disse nevrodegenerative forholdene. Vurderingen av mitokondriefunksjon er arbeidskrevende på grunn av vanskeligheten med isolasjonsmetoden og knappheten på materialet. Dermed er utviklingen av vevspermeabiliseringsteknikker som ikke krever isolering av mitokondrier viktig.
<p class="jove_con…The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi er takknemlige til Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli og Dr. Claudio Masuda for støtten med laboratoriefasiliteter, og Dr. Martha Sorenson for snille og verdifulle kommentarer for å forbedre artikkelen.
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |