Summary
Detta protokoll beskriver ex vivo kalcitonin-genrelaterad peptidfrisättningsmodell (CGRP) och strategin för att kvantifiera effekten av farmakologiska medel på mängden CGRP som frigörs från trigeminovaskulära systemet hos gnagare.
Abstract
Kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) upptäcktes först på 1980-talet som en skarvvariant från kalcitoningenen. Sedan dess upptäckt har dess roll i migrän patofysiologi varit väl etablerad, först genom dess potenta vasodilaterande egenskaper och därefter genom dess närvaro och funktion som en neurotransmittor i det sensoriska trigeminovaskulära systemet. CGRP:s migränframkallande förmåga gav stöd till läkemedelsindustrin att utveckla monoklonala antikroppar och antagonister som hämmar effekten av CGRP. Ett nytt behandlingsparadigm har visat sig vara effektivt vid profylaktisk behandling av migrän. Ett av de användbara verktygen för att ytterligare förstå migränmekanismer är ex vivo-modellen för CGRP-frisättning från trigeminovaskulära systemet. Det är en relativt enkel metod som kan användas med olika farmakologiska verktyg för att uppnå kunskap för att vidareutveckla nya effektiva migränbehandlingar. Detta protokoll beskriver en CGRP-frisättningsmodell och tekniken för att kvantifiera effekten av farmakologiska medel på mängden CGRP som frigörs från det trigeminovaskulära systemet hos gnagare. Ett förfarande som beskriver det experimentella tillvägagångssättet från eutanasi till mätning av proteinnivåer tillhandahålls. Den väsentliga isoleringen av trigeminal ganglion och trigeminalkärnan caudalis från både möss och råttor och beredningen av råtta dura mater beskrivs i detalj. Vidare presenteras representativa resultat från båda arterna (råttor och möss). Tekniken är ett viktigt verktyg för att undersöka de molekylära mekanismerna som är involverade i migränpatofysiologi genom att använda olika farmakologiska föreningar och genetiskt modifierade djur.
Introduction
Migrän är en neurologisk sjukdom som enligt WHO beräknas drabba mer än 1 miljard människor och är en av de främsta orsakerna till funktionshinder världenöver 1. Således har migrän en betydande inverkan på både patienter och samhälle. Trots den senaste tidens kliniska framgång med CGRP-motverkande läkemedel behöver en stor andel av patienterna förbättrade behandlingsalternativ 2,3,4,5. Belysning av migrän patofysiologi som leder till nya effektiva behandlingar krävs. Signalering inom trigeminovaskulära systemet som består av hjärnhinnorna, trigeminusganglierna (TG) och trigeminuskärnan caudalis (TNC) är central för migränpatofysiologi 6,7.
Den 37 aminosyran neuropeptid kalcitonin genrelaterad peptid (CGRP) upptäcktes först i början av 1980-talet när Amara och medarbetare visade att det primära RNA-transkriptet av kalcitoningenen kunde bearbetas för att ge mRNA-kodning för CGRP förutom kalcitonin 8,9. Den efterföljande forskningen föreslog en koppling till migrän patofysiologi10. CGRP är en neurotransmittor med potenta vasodilaterande egenskaper 11,12,13,14,15,16,1 7, och den är utbredd i centrala och perifera nervsystemet 13,14,18,19,20,21,22 . Engagemanget av CGRP i migrän underströks med upptäckten av ökade CGRP-nivåer i den extracerebrala cirkulationen under migränattacker hos människor23, och att infusion av CGRP orsakar migränliknande smärta hos patienter24. Två år senare publicerades den första proof-of-concept-studien av effektiviteten hos CGRP-antagonisten olcegepant vid behandling av migrän25.
CGRP är rikligt i det trigeminovaskulära systemet, vilket demonstreras i TG21,26, sensoriska nervfibrer som innerverar dura mater27,28,29 och TNC30. I det trigeminovaskulära systemet finns CGRP i de små till medelstora neuronerna i TG, i omyeliniserade C-fibrer, och uttrycks i nästan 50% av den neuronala populationen av TG. CGRP-receptorn uttrycks huvudsakligen i större nervceller och finns i myeliniserade Aδ-fibrer31,32. CGRP frigörs från nervceller vid kemisk eller elektrisk stimulering33,34. Studier av vägar som leder till frisättning av CGRP och platsen för denna aktivering är avgörande för att förstå migränpatofysiologi. Under de senaste 5 decennierna har prekliniska studier bidragit till att få omfattande kunskap om migränrelaterad signalering och har bidragit till utveckling av nya behandlingar35. Många metoder med tanke på vaskulär och neurogen involvering har modifierats och tillämpats i migränforskning. In vivo- och in vitro-modeller av arteriella svar på biologiska föreningar eller farmakologiska behandlingar17,36,37 och elektrisk nervstimulering38,39 kan nämnas. Dessutom kan aktiverade neuroner i TNC detekteras med c-Fos-uttryck 40,41,42 och elektrofysiologiska inspelningar i detta område 43,44. Båda metoderna mäter nociceptiva signaler som överförs till hjärnan från huvudet, t.ex. dura mater. Användningen av endast en preklinisk modell presenterar inte hela bilden av migränpatofysiologi. Därför är det viktigt att kombinera olika modeller som täcker så många aspekter av migrän patofysiologi som möjligt. Den fortsatta utvecklingen av nya modeller kommer att täcka olika aspekter av migränmekanismer, och med tiden kommer mysteriet med migränpatofysiologi att avslöjas.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för CGRP-frisättningsmetoden, utförd ex vivo i isolerad TG och TNC från möss efter kemisk stimulering. CGRP-frisättning kan också studeras i dura mater från råttor. I det experimentella protokollet för råttor beskrivs således dura mater tillsammans med TG och TNC. Grunden för CGRP-frisättningsmetoden beskrevs först 1999, där Ebersberger och medarbetare genomförde banbrytande forskning och fann att CGRP frigjordes från dura mater efter kemisk och elektrisk stimulering av dural afferenter hos råttor45. Senare utvidgades detta tillvägagångssätt till CGRP-utgåvan från TG46 och TNC47. Därefter modifierades metoden för att gälla TG och TNC hos möss. Hittills har CGRP-frisättningen från dura mater varit utmanande hos möss.
Protocol
Alla djurvårds- och försöksförfaranden utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapens vägledning för skötsel och användning av djur (2010/63/UE). Manliga C57BL/6JBomTac möss, i åldern 10 veckor, och manliga Sprague Dawley råttor, i åldern 10 veckor, användes för att demonstrera detta protokoll.
1. Beredning av den syntetiska interstitiella vätskan
- Förbered syntetisk interstitiell vätska (SIF) enligt följande recept: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO4, 26 mM NaHCO 3, 11,70 mM NaH 2 PO4, 1,50 mM CaCl2,9,60 mM Na-glukonat, 5,50 mM glukos och 7,60 mM sackaros (se Materialtabell).
OBS: SIF kan varieras beroende på stimuleringsmålet, t.ex. kan en kalciumfri lösning användas när man studerar kalciumkanaler. - Justera pH till 7,4 och stabilisera pH-värdet genom kälkgasning (5% CO2 och 95%O2)46.
2. Dödshjälp
- Bedöva vuxna möss och råttor med en blandning av 70% CO2 och 30%O2. Halshugga möss med en sax och råttor med hjälp av en giljotin (se Materialförteckning).
OBS: Använd en stam och ålder som passar syftet med forskningen. Både män och kvinnor kan användas i denna modell. - Separera huvudet från kroppen på ryggmärgs C3-C4-nivå.
OBS: Eutanasi kan också utföras med en intraperitoneal injektion av pentobarbital (100-150 mg/kg).
3. Dissektion
- Förbered råttvävnaden enligt stegen nedan.
- Ta bort huden och muskeln runt huvud och hals med en sax (figur 1A).
- Använd en bentrimmer och sax för att separera underkäkarna från huvudet (figur 1B-C).
- Öppna ryggmärgen genom att föra in en bentrimmer kaudalt i ryggkotans dorsala del och ta bort ryggkotornas dorsala del för att exponera ryggmärgen och hjärnstammen (figur 1D).
- Skär den kaudala delen av kraniet med gränserna för de occipitala och interparietala benen för att avlägsna dessa benstrukturer som exponerar lillhjärnan (figur 1E).
OBS: Det är viktigt att inte skada hjärnstammen och ryggmärgen när du skär och tar bort ryggkotorna. - Isolera TNC (Sp5C) som löper kaudalt cirka 13-16 mm från bregma på varje sida genom att klippa den dorsolaterala delen av hjärnstammen med fjädersax. Sänk ned vänster och höger sida TNC i SIF (figur 1E-I).
OBS: Beskrivningen motsvarar vuxna råttor. - Skär huvudet mitt i sagitally för att dela kraniet i två med en såg (figur 1J-L).
- Ta försiktigt bort hjärnan utan att röra vid dura mater som är fäst vid kraniet med en spatel och skär trigeminusnerven där den kommer in i hjärnstammen (figur 1M-P).
- För att isolera TG, klippa den, inklusive dess grenar runt de visuella gränserna. Skär den mandibulära grenen där den kommer in i foramen ovale. Skär de oftalmiska och maxillära grenarna som kommer in i skallen eftersom de inte är uppdelade makroskopiskt. När du dissekerar TG, ta bort dura mater som täcker TG (figur 1Q-T).
- Sänk ner kraniumhalvorna och TG: erna i SIF.
- Förbered musvävnaden genom att följa stegen nedan.
- Ta bort hud och muskler runt huvud och hals med en liten sax (figur 2A-B).
- Öppna ryggmärgen genom att föra in en liten sax kaudalt i ryggkotornas ryggdel och ta bort ryggkotornas ryggdel för att exponera ryggmärgen och hjärnstammen (figur 2C).
OBS: Det är viktigt att inte skada ryggmärgen när du skär och tar bort ryggkotorna. - Skär kraniet vid gränserna för de occipitala och interparietala benen för att ta bort dessa benstrukturer som exponerar lillhjärnan (figur 2D-F).
- Skär sedan parietalbenet mitt i sagitally och ta bort benet för att exponera storhjärnan (figur 2G-I).
- Ta försiktigt bort lillhjärnan med en spatel för att exponera hjärnstammen (figur 2J).
- Isolera den TNC-innehållande delen av hjärnstammen med hjälp av fjädersax (figur 2K-N). Sänk ner hjärnstammen med TNC i SIF (figur 2O).
- Ta bort hjärnan och skär trigeminusnerven där den kommer in i hjärnstammen (figur 2P-Q).
- För att isolera TG, klippa den, inklusive dess grenar runt de visuella gränserna. Skär den mandibulära grenen där den kommer in i foramen ovale. Skär de oftalmiska och maxillära grenarna som kommer in i skallen eftersom de inte är uppdelade makroskopiskt. När du dissekerar TG, ta bort dura mater som täcker TG (figur 2R-S).
- Sänk ner TG:er i SIF (figur 2T).
4. Tvätt
- Tvätta skallhalvor, TNC och TG i SIF i 30 minuter medan du byter ut SIF var 5: e minut vid rumstemperatur.
OBS: Tvättstegen kan utföras medan du förvarar vävnaden i plastbehållare med tylllock för att möjliggöra enkelt SIF-utbyte (figur 3A-B). - Förbered råttvävnaden enligt stegen nedan.
- Överför TNC-halvor till separata mikrocentrifugrörslock med 350 μL SIF (figur 3C).
- Överför TG:erna till mikrocentrifugrörslock - en TG per mikrocentrifugrörslock med 350 μl SIF (figur 3C).
- Placera skallhalvorna på plattformar av lera eller en odlingsplatta med 6 brunnar och fyll skallen med 400 μL SIF (figur 3C).
- Förbered musvävnaden genom att följa stegen nedan.
- Överför hjärnstammen med TNC till ett rörlock med mikrocentrifug med 250 μL SIF (figur 3D).
- Överför de två TG:erna till ett mikrocentrifugrörslock med 250 μl SIF (figur 3D).
OBS: Placera två TG per mikrocentrifugrörlock när du använder vävnad från möss.
- Placera råttskallar och mikrocentrifugrörslock med rått- och musvävnad i en fuktad inkubator vid 37 °C. Byt ut SIF med pipett var 5:e minut i 20 min.
OBS: Det är viktigt att inte röra vävnaden när du lägger till och tar bort SIF.
5. Drogtester
- Bestäm de basala CGRP-frisättningsnivåerna.
- Efter den sista tvätten, tillsätt 250 μL SIF till mus TG och TNC. Tillsätt 350 μL till råtta TG och TNC och 400 μl till varje råttskalle.
- Efter 10 minuters inkubation samlar du upp 200 μl av provet i ett mikrocentrifugrör och tillsätter 50 μl 10x EIA-buffert (medföljer CGRP-enzymimmunanalyssatsen, se materialförteckningen) för att möjliggöra mätning av den basala CGRP-frisättningen (steg 6). Kassera den återstående vätskan.
OBS: Inkubationstiden måste vara densamma för alla prover. - Förvara proverna omedelbart vid -20 °C.
- Efter provtagning av basala CGRP-frisättningsnivåer, följ en av de tre metoderna: (A) Enkel stimulering (steg 5.2); B) Stimulering av koncentrations-respons (steg 5.3). och (C) Hämning av stimulering (steg 5.4) (figur 4).
OBS: Testföreningen och koncentrationerna som används beror på syftet med studien.
- Utför enstaka stimulering enligt stegen nedan.
- Tillsätt testsubstans eller vehikel i vävnaden och låt den stå i 10 minuter (volym: 250 μl för mus TG och TNC, 350 μl för råtta TG och TNC och 400 μl för varje råttskalle).
- Efter 10 minuters inkubation samlar du upp 200 μl av provet i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x MKB-buffert. Kassera den återstående vätskan och förvara proverna omedelbart vid -20 °C.
OBS: Inkubationstiden måste vara densamma för alla prover.
- Utför koncentrations-responsstimulering enligt stegen nedan.
- Späd testföreningen eller vehikeln till önskade koncentrationer. Tillsätt testföreningen i ökande koncentrationer som börjar med den lägsta koncentrationen.
OBS: Testföreningen och koncentrationerna som används beror på syftet med studien. Till exempel användes 1 μM, 10 μM och 100 μM supercinnamaldehyd för denna studie. - Tillsätt den lägsta koncentrationen (1 μM för denna studie) av testföreningen och motsvarande vehikel till två identiska vävnadspreparat och inkubera i 10 minuter (volym: 250 μL för musvävnad, 350 μl för råtta TG och TNC och 400 μl för varje råttskalle).
- Efter 10 minuters inkubation samlar du upp 200 μl av provet i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x MKB-buffert.
- Kassera den återstående vätskan och tillsätt den näst lägsta koncentrationen (10 μM för denna studie) till vävnaden.
- Förvara proverna omedelbart vid -20 °C.
- Upprepa denna procedur med de återstående koncentrationerna (100 μM för denna studie).
- Späd testföreningen eller vehikeln till önskade koncentrationer. Tillsätt testföreningen i ökande koncentrationer som börjar med den lägsta koncentrationen.
- Utför hämning av stimulering enligt stegen nedan.
- Tillsätt blockeraren eller vehikeln i vävnaden och inkubera i 10 minuter (volym: 250 μl för musvävnad, 350 μl för råtta TG och TNC och 400 μl för varje råttskalle).
OBS: Blockeraren och koncentrationen som används beror på syftet med studien. Till exempel användes 3 μM glibenklamid för det representativa resultatet i figur 5. - Efter 10 minuters inkubation samlar du upp ett 200 μl-prov i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x EIA-buffert. Kassera den återstående vätskan och förvara proverna omedelbart vid -20 °C.
- Tillsätt agonisten eller agonisten + blockeraren (se materialförteckningen) i vävnaden och inkubera i 10 minuter.
OBS: Agonisten, blockeraren och koncentrationerna som används beror på syftet med studien. I den aktuella studien användes 3 μM glibenklamid och 1 μM capsaicin, figur 5. - Efter 10 minuters inkubation samlar du upp ett 200 μl-prov i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x EIA-buffert. Kassera den återstående vätskan och förvara proverna omedelbart vid -20 °C.
- Tillsätt blockeraren eller vehikeln i vävnaden och inkubera i 10 minuter (volym: 250 μl för musvävnad, 350 μl för råtta TG och TNC och 400 μl för varje råttskalle).
- Utför en positiv kontroll för experimentet.
- När så är lämpligt, tillsätt en positiv kontroll (t.ex. 1–10 μM capsaicin, se materialförteckningen) till vävnaden i slutet av protokollet och samla upp ett prov på 200 μl i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x EIA-buffert efter en inkubationstid på 10 minuter.
OBS: Det är fördelaktigt att inkludera en positiv kontroll för att säkerställa att installationen och vävnaderna fungerar. Capsaicin 48,49,50 eller den depolariserande stimulansen av kalium (40-60 mM av KCl)46,47,49 används rutinmässigt för att orsaka frisättning av CGRP från trigeminovaskulära systemet. 40-60 mM KCl SIF bereds som SIF, förutom att NaCl byts ut mot KCl på ekvimolär basis.
- När så är lämpligt, tillsätt en positiv kontroll (t.ex. 1–10 μM capsaicin, se materialförteckningen) till vävnaden i slutet av protokollet och samla upp ett prov på 200 μl i ett mikrocentrifugrör med 50 μl 10x EIA-buffert efter en inkubationstid på 10 minuter.
6. Analys av CGRP-koncentrationer
- Mät mängden CGRP som frigörs med hjälp av ett enzymimmunanalyskit (EIA) enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning).
- Mät den optiska densiteten vid 410 nm med en plattfotometer. Om ett annat CGRP EIA-kit används, mät den optiska densiteten vid våglängden som anges i tillverkarens protokoll.
OBS: Proverna måste spädas ut för att matcha standardkurvan. - Utför dataanalys.
- Presentera data antingen som absoluta koncentrationer eller normalisera till den basala CGRP-frisättningen från den specifika vävnaden.
Representative Results
Denna teknik är ett verktyg för att undersöka de CGRP-relaterade molekylära mekanismerna som är involverade i migrän. Det har fördelen att bedöma CGRP-frisättning från olika nivåer av det trigeminovaskulära systemet och kan appliceras både på vildtyp och transgena möss och råttor i kombination med olika farmakologiska föreningar. Här presenteras koncentrationsrespons och blockerande experiment från råttor och koncentrationsresponsresultat från vildtyps- och transgena möss.
CGRP-frisättningsmetoden användes för att studera effekten av KATP-kanalhämmaren glibenklamid på CGRP-frisättning från TG och dura mater hos kvinnliga spontana trigeminala allodyniska (STA) råttor. Första, den optimala koncentrationen av capsaicin hittades med hjälp av en koncentration-respons studie design. Capsaicinexponering inducerade en signifikant CGRP-frisättning från dura mater och TG jämfört med vehikeln (figur 5). I dura mater hittades den maximala frisättningen av CGRP vid 1 μM capsaicin, och i TG hittades den maximala CGRP-frisättningen vid 10 μM capsaicin (Figur 5A-B). Baserat på koncentrations-responsexperimenten användes 1 μM capsaicin och 3 μM glibenklamid för blockeringsexperiment. Glibenklamid visade ingen effekt på basal CGRP-frisättning från dura mater (P = 0,441) och TG (P = 0,881) när den analyserades med en enkelriktad ANOVA51. Glibenklamid minskade signifikant den capsaicininducerade CGRP-frisättningen i dura mater med 40% (P = 0,031) och TG med 39% (P = 0,003) jämfört med capsaicin med fordonet när det analyserades med en enkelriktad ANOVA (Figur 5C-D)51.
Hos möss användes protokollet för att undersöka involveringen av den övergående receptorpotentialen ankyrin 1 (TRPA1) jonkanal i en GTN-musmodell av migrän, där GTN-inducerad överkänslighet var helt beroende av TRPA1-kanaler. TRPA1-agonisten supercinnamaldehyd (SCA) visade sig frigöra CGRP på ett dosberoende sätt från TG med 1 μM, 10 μM och 100 μM SCA, vilket resulterade i 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) och 69% (P = 0,0097) ökad frisättning av CGRP jämfört med vehikel, respektive när den analyserades med tvåvägs ANOVA. Denna frisättning saknades i TG från Trpa1 nollmöss där exponering för 1 μM, 10 μM och 100 μM SCA resulterade i 11% (P > 0,99), -13% (P > 0,99) respektive 9% (P = 0,97) procentuell förändring i frisättningen av CGRP jämfört med vehikel, respektive när den analyserades med tvåvägs ANOVA. Den efterföljande stimuleringen med 10 μM capsaicin (positiv kontroll) visar att alla vävnadsprover kan frigöra CGRP (figur 6)50.
Figur 1: Steg-för-steg-dissektion av vävnad från råttor. Informationen (A-T) finns i protokollavsnittet (steg 3.1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Steg-för-steg-dissektion av vävnad från möss. Informationen (A-T) finns i protokollavsnittet (steg 3.2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tvättning och inkubation av gnagarvävnad. (A–B) Nyisolerad vävnad i plastbehållare med SIF. Behållarna är täckta med tyll för att möjliggöra enkelt byte av SIF. (C) Råttvävnad - Två skallhalvor med dura mater som täcker skallens inre foder placerade på en odlingsplatta med 6 brunnar. Den högra och vänstra trigeminuskärnan caudalis i separata mikrocentrifugrörslock (övre raden av lock). De två trigeminala ganglierna i enskilda mikrocentrifugrörslock (nedre raden av lock). (D) Musvävnad - Den trigeminala kärnan caudalis-innehållande del av hjärnstammen i ett separat mikrocentrifugrörlock (överst). Två mus trigeminala ganglier finns i ett mikrocentrifugrörlock (botten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Studiedesign för CGRP-release. Tre olika protokoll för att utföra CGRP-släppexperiment. Läkemedel ska spädas i syntetisk interstitiell vätska (SIF). (A) Enstaka stimulering. (B) Stimulering av koncentrations-respons. (C) Hämning av en stimulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Glibenklamid hämmar capsaicininducerad CGRP-frisättning från råtta dura mater och trigeminal ganglion. CGRP-nivåer från trigeminal ganglion och dura mater isolerade från kvinnliga spontana trigeminala allodyniska (STA) råttor (215-318 g) ursprungligen från Thomas Jefferson University52 mättes med kommersiella humana CGRP EIA-kit. (A–B) CGRP-frisättning från (A) dura mater och (B) trigeminal ganglion efter ökande koncentrationer av capsaicin (10 nM, 100 nM, 1 μM och 10 μM) (n = 4). Data presenteras som enskilda punkter och analyserades med tvåvägs ANOVA. p < 0,0001 (C-D) Nivåer av CGRP frigjorda från (C) dura mater och (D) trigeminal ganglion efter 10 min exponering för vehikel, 3 μM glibenklamid (glib), 1 μM capsaicin och 1 μM capsaicin + 3 μM glib (n = 6-11). Data presenteras som enskilda punkter och medelvärden och analyserades med envägs ANOVA. *jämfört med fordon. #capsaicin jämfört med capsaicin + glib. #P < 0,05, ** och ##P < 0,01, ****P < 0,0001. Analyserna följdes med Bonferronis multipla jämförelsetest. En signifikant nivå av α = 0,05 användes för alla tester. Denna siffra har modifierats från Christensen et al. 51. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: SCA-exponering resulterar i TRPA1-beroende CGRP-frisättning från mustrigeminal ganglion. CGRP-nivåer frigjorda från trigeminal ganglion isolerade från WT och Trpa1 null (Trpa1tm1/Dpc)53 hanmöss (8-10 veckor) mättes med CGRP EIA-kit på råtta efter exponering för supercinnamaldehyd (SCA) vid 1 μM, 10 μM och 100 μM och capsaicin vid 10 μM som en positiv kontroll (n = 6). Data från varje mus presenteras som enskilda punkter och staplar anger medelvärdena. Statistik: Jämförelse mellan SCA och vehikel vid varje koncentration och mellan basal och positiv kontroll utfördes med en tvåvägs upprepad ANOVA. En signifikant nivå på α = 0, 05. *P < 0,05, **P < 0,01. Denna siffra har modifierats från Christensen et al. 50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Metoden som beskrivs utvecklades efter studier som visade betydelsen av CGRP i migränpatofysiologi. Det är väl lämpat för att undersöka mekanismerna som är involverade i frisättningen av CGRP från det trigeminovaskulära systemet, vilket är avgörande för smärtsignalering i huvudregionen. Mängden CGRP som erhålls i denna modell mäter direkt CGRP-frisättning från trigeminusnerverna som innerverar dura mater, TG och TNC. Mängden CGRP-frisättning är kvantitativt större 45,54 än frisättningen mätt i plasma efter termokoagulering hos människor, trigeminusstimulering i katt 39,55,56 och under migränattacker 23. En förklaring kan vara att CGRP späds ut och bryts ned i blodet54. Det bör dock noteras att direkt stimulering med kemikalier kan vara överlägsen patofysiologisk aktivering. Ytterligare fördelar är att det är möjligt att lokalisera utsättningen från tre olika platser inom trigeminovaskulära systemet och att den kan användas tillsammans med farmakologisk manipulation och i vävnad från genetiskt modifierade gnagare.
På senare tid fokuserar många prekliniska gnagarmodeller på systemisk administrering av substanser och efterföljande smärta eller migränrelaterade avläsningar med von Frey-testning57,58, grimaserande59,60,61 eller ljusaversion62,63,64. Dessa metoder är användbara för att förstå de smärtframkallande och smärtlindrande egenskaperna hos olika ämnen. Dessa tillvägagångssätt ger dock ingen information om specifika målvävnader som berörs. I den nuvarande metoden är det trigeminovaskulära systemet uppdelat i tre strukturer: dura mater, TG och TNC. Detta möjliggör lokal exponering av varje struktur och bedömning av verkningsplatsen för ett specifikt ämne. Detta användes i en studie från 2011, där rollen av spänningsstyrda kalciumkanaler hos råttor undersöktes, och hämningen av dessa kanaler visade sig vara annorlunda i de tre strukturerna i den trigeminovaskulära vägen47. Vid dissekering av strukturer i nervsystemet är axotomi oundviklig. Axotomi har visat sig förändra transkriptionen av olika gener65. Dessa transkriptionella förändringar är för långsamma för att påverka resultaten från denna metod, men förändringar i fosforylering kan inte uteslutas jämfört med in vivo-situationer 46. Även om neuropeptider som CGRP bildas i cellen soma, är frisättningen och verkan av neuropeptider vanligtvis vid de centrala eller perifera nervterminalerna. Således är studier av intakta neuroner, inklusive terminaler, intressanta när man studerar neuropeptidfrisättning. Därför har metoder för att studera kulturer av neuroner från isolerade ganglier etablerats för att fungera som en modell av terminalerna. Neuronala cellkulturer är emellertid föremål för flera problem eftersom mekanisk dissociation kan förstöra neuroner i en kultur46. Den längre tidsramen i samband med odling av celler lämnar denna metod känslig för transkriptomiska förändringar på grund av axotomi och odlingsförhållanden65. Vidare har tillsatsen av tillväxtfaktorer och odling på ytbeläggningar förändrat neuronala egenskaper som sändare och receptoruttryck66,67,68,69. Dessa problem undviks när man studerar nyligen isolerade intakta ganglier istället för neuronala cellkulturer.
En utmaning med ex vivo CGRP-frisättningsmetoden är den exakta dissektion av vävnaden som krävs för reproducerbara resultat. Särskilt noggrann dissektion av TNC är utmanande eftersom detta är en struktur i hjärnstammen utan synliga gränser. Dessutom är dura mater ömtålig, och avlägsnande av hjärnan måste utföras noggrant för att säkerställa en intakt struktur. Dessa hinder kan resultera i varierande vävnadsstorlek och därmed varierande basala och stimuleringsinducerade CGRP-nivåer. Denna variation kan emellertid förklaras genom normalisering till den basala CGRP-frisättningen. Det bör också noteras att när man isolerar TNC från möss isoleras hela den nedre delen av hjärnstammen och inte den mer specifika TNC-innehållande delen som görs hos råttor. I allmänhet kan det vara en fördel att använda råttvävnad, eftersom detta möjliggör mätning av CGRP-frisättning från dura mater och mer exakt dissektion av TNC. Dessutom möjliggör vävnadens storlek också användningen av en råtta som sin vehikelkontroll, eftersom en råtta resulterar i två kraniumhalvor, två TG och två TNC där en bit av vävnaden används för substansstimulering och den andra för vehikeln. Vid användning av möss behövs två djur för ett experiment eftersom båda TG: erna poolas i ett prov och TNC: erna dissekeras som en hjärnstam. Därför används två TG och en hjärnstam för substansstimulering, och två TG och en hjärnstam från en annan mus används för fordonskontroll. Detta resulterar i att använda dubbelt så många möss jämfört med råttor för att få samma antal replikat. För att minska antalet möss som används har en metod för att mäta CGRP-frisättning från hjärnstamsskivor föreslagits49. Det är en fördel att metoden har modifierats för att möjliggöra användning av möss. Detta möjliggör användning av många redan tillgängliga transgena musstammar, ett användbart verktyg för att studera t.ex. signalvägar. En positiv kontroll i slutet av ett experiment bör inkluderas för att säkerställa att vävnaden som används i experimentet kan frigöra CGRP. Den positiva kontrollen kan vara TRPV1-agonist capsaicin eller det depolariserande stimulanskalium (KCl), som har visat sig frigöra CGRP från trigeminovaskulära systemet hos både möss och råttor 46,47,48,49,50. Vidare har metoden även anpassats för att mäta frisättningen av andra relevanta peptider som hypofysadenylatcyklasaktiverande peptid (PACAP) - en annan peptid av stort intresse inom migränforskning70.
Metoden ger ett användbart verktyg för att undersöka CGRP-frisättning från specifika målvävnader hos råttor och möss. Det är en relativt snabb metod som undviker problem i samband med odling av nervceller. Metodprotokollet kan enkelt modifieras för att studera förhållandet mellan koncentration och respons eller hämning av ett svar av olika farmakologiska föreningar. Ex vivo CGRP-frisättningsmetoden är en av flera prekliniska metoder som är användbara för att studera rollen av CGRP och andra mekanismer relaterade till CGRP-frisättning i migränpatofysiologi.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Candys Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture plate | NUNC | 140675 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 1.02382.1000 | For SIF buffer |
| Caps for plastic containers | ThermoFisher Scientific | 536617 | |
| Capsaicin | Merck | M2028 | |
| CGRP kits | AH Diagnostics | A05482.96 | |
| CO2 | Strandmøllen | 4.6 | For carbogen gassing of SIF |
| Delicate Bone Trimmer | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Glibenclamide | Tocris | 911 | |
| Glucose | Merck | G7021 | For SIF buffer |
| Guillotine for rats | Scandidact | NS-802 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | M5921 | For SIF buffer |
| Microcenrifuge tubes + lids/caps | VWR | 700-5239 | |
| Mini Hacksaw | BAHCO | 208 | |
| O2 | Strandmøllen | 4.5 | For carbogen gassing of SIF |
| Pentobarbital | Glostrup pharmacy | NA | Magistral formula |
| Plastic containers | ThermoFisher Scientific | 536455 | |
| Plate photometer - Infinite M200 | Tecan | NA | Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan. Software: SW Magellan v.6.3 |
| Potassium chloride | Merck | P9333 | For SIF buffer |
| Scissor | Allgaier Instruments | 307-156-170 | |
| Small scissor | Allgaier Instruments | 04-520-115 | |
| Sodium bicarbonate | Merck | S6014 | For SIF buffer |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | For SIF buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 1.06346.1000 | For SIF buffer |
| Sodium gluconate | Merck | S2054 | For SIF buffer |
| Spatula | Bochem Lab Supply | 3018 | |
| Spring scissor | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sucrose | Merck | 84097 | For SIF buffer |
| Supercinnamaldehyde | Merck | S3322 | |
| Tulle (fabrics) | NA | NA | Bought in the local fabrics store |
References
- GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
- Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
- Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
- Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
- Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
- Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
- Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
- Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
- Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
- Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
- Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
- Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
- Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
- Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
- Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
- Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
- Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
- Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
- Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
- Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
- Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
- Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
- Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
- Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
- Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
- Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
- Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
- Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
- Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
- Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
- Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
- Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
- Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
- Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
- Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
- Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
- Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
- Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
- Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
- Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
- Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
- Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
- Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
- Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
- Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
- Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
- Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
- Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
- Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
- Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
- Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
- Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
- Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
- Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
- Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
- Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
- Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).
