Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ubiquinone (CoQ) pools in het binnenste mitochondriale membraan (IMM) zijn gedeeltelijk gesegmenteerd tot complexe I- of FAD-afhankelijke enzymen. Een dergelijke onderverdeling kan gemakkelijk worden beoordeeld door een vergelijkende test met NADH of succinaat als elektronendonor in bevroren ontdooide mitochondriën, waarin cytochroom c (cyt c) reductie wordt gemeten. De test is gebaseerd op het effect van Na + op de IMM, waardoor de vloeibaarheid ervan afneemt. Hier presenteren we een protocol om NADH-cyt c oxidoreductase-activiteit en succinaat-cyt c oxidoreductase-activiteiten te meten in aanwezigheid van NaCl of KCl. De reacties, die afhankelijk zijn van het mengsel van reagentia in een cuvette stapsgewijs, worden gedurende 4 minuten spectrofotometrisch gemeten in aanwezigheid van Na+ of K+. Hetzelfde mengsel wordt parallel uitgevoerd in aanwezigheid van de specifieke enzymremmers om de niet-specifieke verandering in absorptie af te trekken. Nadh-cyt c oxidoreductase activiteit neemt niet af in de aanwezigheid van een van deze kationen. De activiteit van succinaat-cyt c oxidoreductase neemt echter af in de aanwezigheid van NaCl. Dit eenvoudige experiment benadrukt: 1) het effect van Na + bij het verminderen van IMM-vloeibaarheid en CoQ-overdracht; 2) dat supercomplex I+III2 de overdracht van ubiquinon (CoQ) beschermt tegen beïnvloeding door verlaging van de IMM-vloeibaarheid; 3) dat CoQ-overdracht tussen CI en CIII functioneel verschilt van CoQ-overdracht tussen CII en CIII. Deze feiten ondersteunen het bestaan van functioneel gedifferentieerde CoQ-pools in de IMM en tonen aan dat ze kunnen worden gereguleerd door de veranderende Na + -omgeving van mitochondriën.
Inleiding
Mitochondriaal oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) is de belangrijkste route die adenosinetrifosfaat (ATP) synthese, reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie en consumptie van reducerende equivalenten, zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) of succinaat, door mitochondriën aandrijft. OXPHOS-systeem bestaat uit vijf eiwitcomplexen: Complex I (CI) oxideert NADH en reduceert CoQ tot ubiquinol (CoQH2). Complex II (CII) oxideert succinaat tot fumaraat en reduceert CoQ tot CoQH2. Complex III (CIII) oxideert CoQH2 terug tot CoQ, waardoor cytochroom c (cyt c) wordt verminderd. Ten slotte oxideert complex IV (CIV) cyt c en reduce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spanje, in overeenstemming met de richtlijn van de Europese Unie van 22 september 2010 (2010/63/UE) en met het Spaanse koninklijk besluit van 1 februari 2013 (53/2013). Alles werd in het werk gesteld om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren.
OPMERKING: Deze vergelijkende test om de segmentatie van mitochondriale CoQ-pools te bestuderen, wordt als volgt beschreven:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Typische resultaten van dit protocol zijn hieronder weergegeven (figuur 3). Aangezien de verminderde cyt c-absorptie zich bij 550 nm bevindt, moeten alle onbevangen subsamples een toename van de absorptie bij 550 nm vertonen. Geremde subsamples vertonen idealiter een vlakke lijn of licht toenemende helling (figuur 3). Hellingen van geremde subsamples moeten worden afgetrokken van ongeremde subsamples.
Monsters A en B, beide gecorrigee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel dit protocol een zeer eenvoudige procedure vertegenwoordigt om het bestaan van de gedeeltelijk gesegmenteerde CoQ-pools te identificeren, zijn er een paar kritieke stappen om rekening mee te houden. Substraten (d.w.z. NADH of succinaat) worden bij voorkeur als laatste toegevoegd, omdat autooxidatie van deze verbindingen kan optreden. Cuvette moet voorzichtig zijn om de vorming van bubbels te voorkomen die de meting kunnen verstoren.
Bovendien biedt de huidige techniek een paar beperking.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr C. Jimenez en E. R. Martínez-Jimenez voor technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door MICIN: RTI2018-099357-B-I00 en HFSP (RGP0016/2018). Het CNIC wordt ondersteund door het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) en de Pro CNIC Foundation en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figuur 2 gemaakt met BioRender.com.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford-eiwittest | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochroom c uit paardenhart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonzuur | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Kaliumcyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | versie 2 | |
| Spectrofotometer | UV/VIS JASCO | ||
| Succinaat | Sigma-Aldrich | 398055 |
Referenties
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory superc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
