ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה
Summary
ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.
Abstract
טכניקות של מולקולה בודדת המבוססות על עקרונות פלואורסצנטיים ומכנוכימיים מספקות רגישות מעולה בחישה ביולוגית. עם זאת, בשל היעדר יכולות תפוקה גבוהות, היישום של טכניקות אלה מוגבל בביופיזיקה. ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים על ידי המרת מחקרים מכניכימיים של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים. בפרוטוקול זה, המבנים המשניים של הדנ”א (i-motifs) נפרשו בזרימת הגזירה בין הרוטור לסטטור של קצה הומוגנייזר בקצבי גזירה של עד 77796/s. הודגמו ההשפעות של קצבי הזרימה והגדלים המולקולריים על כוחות הגזירה שחווה ה-i-motif. טכניקת EFS חשפה גם את הזיקה המחייבת בין מוטיבים של דנ”א לליגנדים. יתר על כן, הדגמנו תגובת כימיה של קליקים שיכולה להיות מופעלת על ידי כוח גזירה (כלומר, כימיה של מכניקה-קליק). תוצאות אלה מבססות את היעילות של שימוש בכוח גזירה כדי לשלוט על הקונפורמציה של מבנים מולקולריים.
Introduction
בספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת1 (SMFS), התכונות המכניות של מבנים מולקולריים בודדים נחקרו על ידי מכשירים מתוחכמים כגון מיקרוסקופ הכוח האטומי, פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית 2,3,4. מוגבל על ידי אותה דרישת כיווניות של המולקולות במערך יצירת הכוח / גילוי או שדה הראייה הקטן בפינצטה מגנטית ובמיקרוסקופ כוח צנטריפוגה זעיר (MCF)5,6,7,8, רק מספר מוגבל של מולקולות ניתן לחקור בו זמנית באמצעות SMFS. התפוקה הנמוכה של SMFS מונעת את היישום הרחב שלה בתחום הזיהוי המולקולרי, הדורש מעורבות של קבוצה גדולה של מולקולות.
זרימת גזירה מספקת פתרון פוטנציאלי להפעלת כוחות על קבוצה מסיבית של מולקולות9. בזרימה נוזלית בתוך ערוץ, ככל שפני התעלה קרובים יותר לפני הערוץ, כך קצב הזרימהאיטי יותר 10. שיפוע מהירות זרימה כזה גורם ללחץ גזירה המקביל למשטח הגבול. כאשר מולקולה ממוקמת בזרימת גזירה זו, המולקולה מכוונת את עצמה מחדש כך שהציר הארוך שלה מתיישר עם כיוון הזרימה, כאשר כוח הגזירה מופעל על ציר11 הארוך. כתוצאה משינוי כיוון זה, כל המולקולות מאותו סוג (גודל ואורך הידיות) צפויות להתיישר באותו כיוון תוך שהן חוות את אותו כוח גזירה.
עבודה זו מתארת פרוטוקול לשימוש בזרימת גזירה כזו כדי להפעיל כוח גזירה על קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים, כפי שמודגם על ידי מוטיב ה- i של הדנ”א. בפרוטוקול זה נוצרת זרימת גזירה בין הרוטור לסטטור בקצה הומוגנייזר. המחקר הנוכחי מצא כי מבנה הדנ”א המקופל i-motif יכול להיפתח על ידי קצבי גזירה של 9724-97245 s−1. חוץ מזה, נמצא קבוע דיסוציאציה של 36 μM בין ליגנד L2H2-4OTD לבין מוטיב i. ערך זה עולה בקנה אחד עם זה של 31 μM שנמדד על ידי מבחן הסטת הג’ל12. יתר על כן, הטכניקה הנוכחית משמשת כדי לפתוח את מוטיב i, אשר יכול לחשוף את נחושת chelated (I) כדי לזרז תגובת קליק. פרוטוקול זה מאפשר אפוא לפתוח קבוצה גדולה של מבני i-motif עם מכשירים בעלות נמוכה בזמן סביר (קצר מ -30 דקות). בהתחשב בכך שטכניקת כוח הגזירה מגדילה באופן דרסטי את התפוקה של ספקטרוסקופיית הכוח, אנו מכנים טכניקה זו ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS). פרוטוקול זה נועד לספק הנחיות ניסיוניות כדי להקל על היישום של EFS מבוסס כוח גזירה זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר חקירה בזמן אמת של התגלגלות מערך של מבנים ביומולקולריים על ידי כוח גזירה. התוצאות המוצגות כאן מדגישות כי מבנים של מוטיב דנ”א ניתנים לפתיחה על ידי כוח גזירה. התגלגלותו של מוטיב ה-i הקשור לליגנד ותגובות הקליק המופעלות בכוח הגזירה היו יישומים של הוכחת היתכנות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודת מחקר זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע [CBET-1904921] והמכונים הלאומיים לבריאות [NIH R01CA236350] ל- H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
