Ensemble Force spektroskopi av Shear Forces
Summary
Ensemble force spectroscopy (EFS) er en robust teknikk for mekanisk utfoldelse og sanntidsregistrering av et ensemblesett av biomolekylære strukturer i biofysiske og biosenserende felt.
Abstract
Enkeltmolekylteknikker basert på fluorescens og mekanokjemiske prinsipper gir overlegen følsomhet i biologisk sensing. På grunn av mangelen på høy gjennomstrømningskapasitet er anvendelsen av disse teknikkene imidlertid begrenset i biofysikk. Ensemblekraftspektroskopi (EFS) har vist høy gjennomstrømning i undersøkelsen av et massivt sett med molekylære strukturer ved å konvertere mekanokjemiske studier av individuelle molekyler til molekylære ensembler. I denne protokollen ble DNA-sekundære strukturer (i-motiver) brettet ut i skjærstrømmen mellom rotoren og statoren til en homogenisatorspiss ved skjærhastigheter opp til 77796/s. Effektene av strømningshastigheter og molekylstørrelser på skjærkreftene som oppleves av i-motivet ble demonstrert. EFS-teknikken avslørte også bindingsaffiniteten mellom DNA i-motiver og ligander. Videre har vi demonstrert en klikkkjemireaksjon som kan aktiveres av skjærkraft (dvs. mekano-klikkkjemi). Disse resultatene fastslår effektiviteten av å bruke skjærkraft for å kontrollere konformasjonen av molekylære strukturer.
Introduction
I enkeltmolekylkraftspektroskopi 1 (SMFS) har de mekaniske egenskapene til individuelle molekylære strukturer blitt studert av sofistikerte instrumenter som atomkraftmikroskopet, optisk pinsett og magnetisk pinsett 2,3,4. Begrenset av det samme direksjonalitetskravet til molekylene i kraftgenererende / detekterende oppsett eller det lille synsfeltet i magnetisk pinsett og miniatyrsentrifugekraftmikroskopet (MCF) 5,6,7,8, kan bare et begrenset antall molekyler undersøkes samtidig ved hjelp av SMFS. Den lave gjennomstrømningen av SMFS forhindrer dens brede anvendelse i molekylær anerkjennelsesfelt, noe som krever involvering av et stort sett med molekyler.
Skjærstrøm gir en potensiell løsning for å påføre krefter på et massivt sett med molekyler9. I en væskestrøm inne i en kanal, jo nærmere kanaloverflaten, jo langsommere strømningshastigheten10. En slik strømningshastighetsgradient forårsaker skjærspenning som er parallell med grenseflaten. Når et molekyl er plassert i denne skjærstrømmen, reorienterer molekylet seg slik at den lange aksen justerer seg med strømningsretningen, ettersom skjærkraften påføres den lange aksen11. Som et resultat av denne nyorienteringen forventes alle molekylene av samme type (størrelse og lengde på håndtakene) å justere seg i samme retning mens de opplever samme skjærkraft.
Dette arbeidet beskriver en protokoll for å bruke en slik skjærstrøm for å utøve skjærkraft på et massivt sett med molekylære strukturer, som eksemplifisert av DNA i-motivet. I denne protokollen genereres en skjærstrøm mellom rotoren og statoren i en homogenisatorspiss. Den foreliggende studien fant at den brettede DNA i-motivstrukturen kunne utfoldes med skjærhastigheter på 9724-97245 s−1. Dessuten ble det funnet en dissosiasjonskonstant på 36 μM mellom L2H2-4OTD-liganden og i-motivet. Denne verdien er i samsvar med verdien på 31 μM målt ved gelskiftanalysen12. Videre brukes den nåværende teknikken til å utfolde i-motivet, som kan eksponere chelatert kobber (I) for å katalysere en klikkreaksjon. Denne protokollen gjør det dermed mulig å utfolde et stort sett med i-motivstrukturer med rimelige instrumenter innen rimelig tid (kortere enn 30 min). Gitt at skjærkraftteknikken drastisk øker gjennomstrømningen av kraftspektroskopien, kaller vi denne teknikken ensemble force spectroscopy (EFS). Denne protokollen tar sikte på å gi eksperimentelle retningslinjer for å lette anvendelsen av denne skjærkraftbaserte EFS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet tillater sanntidsundersøkelse av utfoldelsen av et ensemblesett av biomolekylære strukturer med skjærkraft. Resultatene som presenteres her understreker at DNA-i-motivstrukturer kan utfoldes med skjærkraft. Utfoldelsen av det ligandbundne i-motivet og skjærkraftaktiverte klikkreaksjoner var proof-of-concept-applikasjoner for denne ensemblekraftspektroskopimetoden.
Figur 1 viser instrumentoppsettet. Homogenisatorgener…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsarbeidet ble støttet av National Science Foundation [CBET-1904921] og National Institutes of Health [NIH R01CA236350] til HM.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
