Ensemble Force Spektroskopi av Shear Forces
Summary
Ensemblekraftspektroskopi (EFS) är en robust teknik för mekanisk utveckling och realtidsavkänning av en ensembleuppsättning biomolekylära strukturer i biofysiska och biosensingfält.
Abstract
Enmolekylära tekniker baserade på fluorescens och mekanokemiska principer ger överlägsen känslighet vid biologisk avkänning. På grund av bristen på hög genomströmningskapacitet är dock tillämpningen av dessa tekniker begränsad inom biofysik. Ensemblekraftspektroskopi (EFS) har visat hög genomströmning i undersökningen av en massiv uppsättning molekylära strukturer genom att omvandla mekanokemiska studier av enskilda molekyler till molekylära ensembler. I detta protokoll utvecklades DNA-sekundära strukturer (i-motiv) i skjuvflödet mellan rotorn och statorn på en homogenisatorspets vid skjuvhastigheter upp till 77796/s. Effekterna av flödeshastigheter och molekylstorlekar på skjuvkrafterna som i-motivet upplevde demonstrerades. EFS-tekniken avslöjade också bindningsaffiniteten mellan DNA-i-motiv och ligander. Dessutom har vi demonstrerat en klickkemisk reaktion som kan aktiveras av skjuvkraft (dvs mekano-klickkemi). Dessa resultat fastställer effektiviteten av att använda skjuvkraft för att kontrollera konformationen av molekylära strukturer.
Introduction
I enmolekylär kraftspektroskopi1 (SMFS) har de mekaniska egenskaperna hos enskilda molekylära strukturer studerats med sofistikerade instrument såsom atomkraftmikroskopet, optisk pincett och magnetisk pincett 2,3,4. Begränsad av samma riktningskrav för molekylerna i de kraftgenererande/detekterande inställningarna eller det lilla synfältet i magnetisk pincett och miniatyrcentrifugkraftmikroskopet (MCF)5,6,7,8, kan endast ett begränsat antal molekyler undersökas samtidigt med hjälp av SMFS. Den låga genomströmningen av SMFS förhindrar dess breda tillämpning inom molekylärigenkänningsfältet, vilket kräver involvering av en stor uppsättning molekyler.
Skjuvflöde ger en potentiell lösning för att applicera krafter på en massiv uppsättning molekyler9. I ett vätskeflöde inuti en kanal, ju närmare kanalytan, desto långsammare är flödeshastigheten10. En sådan flödeshastighetsgradient orsakar skjuvspänning som är parallell med gränsytan. När en molekyl placeras i detta skjuvflöde omorienterar molekylen sig själv så att dess långa axel ligger i linje med flödesriktningen, eftersom skjuvkraften appliceras på den långa axeln11. Som ett resultat av denna omorientering förväntas alla molekyler av samma typ (storlek och längd på handtag) att rikta sig i samma riktning medan de upplever samma skjuvkraft.
Detta arbete beskriver ett protokoll för att använda ett sådant skjuvflöde för att utöva skjuvkraft på en massiv uppsättning molekylära strukturer, vilket exemplifieras av DNA-i-motivet. I detta protokoll genereras ett skjuvflöde mellan rotorn och statorn i en homogenisatorspets. Den aktuella studien fann att den vikta DNA-i-motivstrukturen kunde utvecklas med skjuvhastigheter på 9724-97245 s−1. Dessutom hittades en dissociationskonstant på 36 μM mellan L2H2-4OTD-liganden och i-motivet. Detta värde överensstämmer med värdet på 31 μM mätt med gelskiftanalysen12. Vidare används den nuvarande tekniken för att veckla ut i-motivet, vilket kan exponera den kelaterade kopparen (I) för att katalysera en klickreaktion. Detta protokoll gör det alltså möjligt för en att utveckla en stor uppsättning i-motivstrukturer med billiga instrument på rimlig tid (kortare än 30 min). Med tanke på att skjuvkraftstekniken drastiskt ökar genomströmningen av kraftspektroskopin kallar vi denna teknik ensemblekraftspektroskopi (EFS). Detta protokoll syftar till att tillhandahålla experimentella riktlinjer för att underlätta tillämpningen av denna skjuvkraftbaserade EFS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta manuskript möjliggör realtidsundersökning av utvecklingen av en ensembleuppsättning biomolekylära strukturer genom skjuvkraft. Resultaten som presenteras här understryker att DNA-i-motivstrukturer kan utvecklas med skjuvkraft. Utvecklingen av det ligandbundna i-motivet och skjuvkraftsaktiverade klickreaktionerna var proof-of-concept-applikationer för denna ensemblekraftspektroskopimetod.
Figur 1 visar instrumentets inställn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta forskningsarbete stöddes av National Science Foundation [CBET-1904921] och National Institutes of Health [NIH R01CA236350] till H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
