Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests
Summary
Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.
Abstract
Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en de incidentie van vele soorten kanker blijft toenemen. Er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van screening, preventie en behandeling; Preklinische modellen die het chemosensitiviteitsprofiel van kankerpatiënten voorspellen, ontbreken echter nog. Om deze leemte op te vullen, werd een in vivo patiënt-afgeleid xenograftmodel ontwikkeld en gevalideerd. Het model was gebaseerd op zebravis (Danio rerio) embryo’s op 2 dagen na de bevruchting, die werden gebruikt als ontvangers van xenograft fragmenten van tumorweefsel genomen van het chirurgische monster van een patiënt.
Het is ook vermeldenswaard dat bioptische monsters niet werden verteerd of uitgesplitst, om de micro-omgeving van de tumor te behouden, wat cruciaal is in termen van het analyseren van tumorgedrag en de respons op therapie. Het protocol beschrijft een methode voor het vaststellen van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) van primaire solide tumorchirurgische resectie. Na screening door een anatomopatholoog wordt het monster ontleed met behulp van een scalpelmesje. Necrotisch weefsel, bloedvaten of vetweefsel worden verwijderd en vervolgens in stukjes van 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm gehakt.
De stukjes worden vervolgens fluorescerend gelabeld en xenotransplanteerd in de perivitellineruimte van zebravisembryo’s. Een groot aantal embryo’s kan tegen lage kosten worden verwerkt, waardoor in vivo analyses met een hoge doorvoer van de chemosensitiviteit van zPDX’s voor meerdere geneesmiddelen tegen kanker mogelijk zijn. Confocale beelden worden routinematig verkregen om de apoptotische niveaus geïnduceerd door chemotherapiebehandeling te detecteren en te kwantificeren in vergelijking met de controlegroep. De xenograftprocedure heeft een aanzienlijk tijdsvoordeel, omdat deze in één dag kan worden voltooid, waardoor een redelijk tijdsbestek wordt geboden om een therapeutische screening voor coklinische onderzoeken uit te voeren.
Introduction
Een van de problemen van klinisch kankeronderzoek is dat kanker geen enkele ziekte is, maar een verscheidenheid aan verschillende ziekten die in de loop van de tijd kunnen evolueren en specifieke behandelingen vereisen, afhankelijk van de kenmerken van de tumor zelf en de patiënt1. Bijgevolg is de uitdaging om naar patiëntgericht kankeronderzoek te gaan, om nieuwe gepersonaliseerde strategieën te identificeren voor de vroege voorspelling van kankerbehandelingsresultaten2. Dit is met name relevant voor pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC), omdat het wordt beschouwd als een moeilijk te behandelen kanker, met een 5-jaarsoverleving van 11%3.
De late diagnose, snelle progressie en het gebrek aan effectieve therapieën blijven de meest urgente klinische problemen van PDAC. De belangrijkste uitdaging is daarom om de patiënt te modelleren en biomarkers te identificeren die in de kliniek kunnen worden toegepast om de meest effectieve therapie te selecteren in overeenstemming met gepersonaliseerde geneeskunde 4,5,6. In de loop van de tijd zijn nieuwe benaderingen voorgesteld om kankerziekten te modelleren: patiënt-afgeleide organoïden (PDO’s) en muispatiënt-afgeleide xenografts (mPDXs) afkomstig van een bron van menselijk tumorweefsel. Ze zijn gebruikt om de ziekte te reproduceren om de respons en de resistentie tegen therapie te bestuderen, evenals ziekterecidief 7,8,9.
Evenzo is de interesse in zebravis-gebaseerde patiënt-afgeleide xenograft (zPDX) -modellen toegenomen, dankzij hun unieke en veelbelovende kenmerken10, wat een snel en goedkoop hulpmiddel is voor kankeronderzoek11,12. zPDX-modellen vereisen slechts een kleine tumorsteekproefgrootte, waardoor screening van chemotherapie met hoge doorvoer haalbaar is13. De meest gebruikte techniek voor zPDX-modellen is gebaseerd op volledige monstervertering en implantatie van de primaire celpopulaties, die de tumor gedeeltelijk reproduceert, maar de nadelen heeft van een gebrek aan tumormicro-omgeving en overspraak tussen kwaadaardige en gezonde cellen14.
Dit werk laat zien hoe zPDXs kunnen worden gebruikt als een preklinisch model om het chemosensitiviteitsprofiel van patiënten met alvleesklierkanker te identificeren. De waardevolle strategie vergemakkelijkt het xenograftproces, omdat er geen celuitbreiding nodig is, waardoor de chemotherapiescreening kan worden versneld. De kracht van het model is dat alle micro-omgevingscomponenten worden gehandhaafd zoals ze zijn in het kankerweefsel van de patiënt, omdat, zoals bekend, het gedrag van de tumor afhangt van hun samenspel15,16. Dit is zeer gunstig ten opzichte van alternatieve methoden in de literatuur, omdat het mogelijk is om de heterogeniteit van de tumor te behouden en bij te dragen aan het verbeteren van de voorspelbaarheid van de behandelingsuitkomst en terugval op een patiëntspecifieke manier, waardoor het zPDX-model kan worden gebruikt in coklinische onderzoeken. Dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het maken van het zPDX-model, te beginnen met een stuk tumorresectie van de patiënt en het behandelen ervan om de respons op chemotherapie te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo modellen in kankeronderzoek bieden onschatbare hulpmiddelen om kankerbiologie te begrijpen en de respons op kankerbehandeling te voorspellen. Momenteel zijn er verschillende in vivo modellen beschikbaar, bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde dieren (transgene en knock-out muizen) of van patiënten afgeleide xenografts uit menselijke primaire cellen. Ondanks vele optimale functies, heeft elk ervan verschillende beperkingen. In het bijzonder missen de bovengenoemde modellen een betrouwbare manier …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Fondazione Pisa (project 114/16). De auteurs willen Raffaele Gaeta van de Histopathologie Unit van Azienda Ospedaliera Pisana bedanken voor de selectie van patiëntenmonsters en pathologieondersteuning. We bedanken ook Alessia Galante voor de technische ondersteuning bij de experimenten. Dit artikel is gebaseerd op werk van COST Action TRANSPAN, CA21116, ondersteund door COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
