Summary
Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.
Abstract
Kanker is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en de incidentie van vele soorten kanker blijft toenemen. Er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van screening, preventie en behandeling; Preklinische modellen die het chemosensitiviteitsprofiel van kankerpatiënten voorspellen, ontbreken echter nog. Om deze leemte op te vullen, werd een in vivo patiënt-afgeleid xenograftmodel ontwikkeld en gevalideerd. Het model was gebaseerd op zebravis (Danio rerio) embryo's op 2 dagen na de bevruchting, die werden gebruikt als ontvangers van xenograft fragmenten van tumorweefsel genomen van het chirurgische monster van een patiënt.
Het is ook vermeldenswaard dat bioptische monsters niet werden verteerd of uitgesplitst, om de micro-omgeving van de tumor te behouden, wat cruciaal is in termen van het analyseren van tumorgedrag en de respons op therapie. Het protocol beschrijft een methode voor het vaststellen van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) van primaire solide tumorchirurgische resectie. Na screening door een anatomopatholoog wordt het monster ontleed met behulp van een scalpelmesje. Necrotisch weefsel, bloedvaten of vetweefsel worden verwijderd en vervolgens in stukjes van 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm gehakt.
De stukjes worden vervolgens fluorescerend gelabeld en xenotransplanteerd in de perivitellineruimte van zebravisembryo's. Een groot aantal embryo's kan tegen lage kosten worden verwerkt, waardoor in vivo analyses met een hoge doorvoer van de chemosensitiviteit van zPDX's voor meerdere geneesmiddelen tegen kanker mogelijk zijn. Confocale beelden worden routinematig verkregen om de apoptotische niveaus geïnduceerd door chemotherapiebehandeling te detecteren en te kwantificeren in vergelijking met de controlegroep. De xenograftprocedure heeft een aanzienlijk tijdsvoordeel, omdat deze in één dag kan worden voltooid, waardoor een redelijk tijdsbestek wordt geboden om een therapeutische screening voor coklinische onderzoeken uit te voeren.
Introduction
Een van de problemen van klinisch kankeronderzoek is dat kanker geen enkele ziekte is, maar een verscheidenheid aan verschillende ziekten die in de loop van de tijd kunnen evolueren en specifieke behandelingen vereisen, afhankelijk van de kenmerken van de tumor zelf en de patiënt1. Bijgevolg is de uitdaging om naar patiëntgericht kankeronderzoek te gaan, om nieuwe gepersonaliseerde strategieën te identificeren voor de vroege voorspelling van kankerbehandelingsresultaten2. Dit is met name relevant voor pancreas ductaal adenocarcinoom (PDAC), omdat het wordt beschouwd als een moeilijk te behandelen kanker, met een 5-jaarsoverleving van 11%3.
De late diagnose, snelle progressie en het gebrek aan effectieve therapieën blijven de meest urgente klinische problemen van PDAC. De belangrijkste uitdaging is daarom om de patiënt te modelleren en biomarkers te identificeren die in de kliniek kunnen worden toegepast om de meest effectieve therapie te selecteren in overeenstemming met gepersonaliseerde geneeskunde 4,5,6. In de loop van de tijd zijn nieuwe benaderingen voorgesteld om kankerziekten te modelleren: patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) en muispatiënt-afgeleide xenografts (mPDXs) afkomstig van een bron van menselijk tumorweefsel. Ze zijn gebruikt om de ziekte te reproduceren om de respons en de resistentie tegen therapie te bestuderen, evenals ziekterecidief 7,8,9.
Evenzo is de interesse in zebravis-gebaseerde patiënt-afgeleide xenograft (zPDX) -modellen toegenomen, dankzij hun unieke en veelbelovende kenmerken10, wat een snel en goedkoop hulpmiddel is voor kankeronderzoek11,12. zPDX-modellen vereisen slechts een kleine tumorsteekproefgrootte, waardoor screening van chemotherapie met hoge doorvoer haalbaar is13. De meest gebruikte techniek voor zPDX-modellen is gebaseerd op volledige monstervertering en implantatie van de primaire celpopulaties, die de tumor gedeeltelijk reproduceert, maar de nadelen heeft van een gebrek aan tumormicro-omgeving en overspraak tussen kwaadaardige en gezonde cellen14.
Dit werk laat zien hoe zPDXs kunnen worden gebruikt als een preklinisch model om het chemosensitiviteitsprofiel van patiënten met alvleesklierkanker te identificeren. De waardevolle strategie vergemakkelijkt het xenograftproces, omdat er geen celuitbreiding nodig is, waardoor de chemotherapiescreening kan worden versneld. De kracht van het model is dat alle micro-omgevingscomponenten worden gehandhaafd zoals ze zijn in het kankerweefsel van de patiënt, omdat, zoals bekend, het gedrag van de tumor afhangt van hun samenspel15,16. Dit is zeer gunstig ten opzichte van alternatieve methoden in de literatuur, omdat het mogelijk is om de heterogeniteit van de tumor te behouden en bij te dragen aan het verbeteren van de voorspelbaarheid van de behandelingsuitkomst en terugval op een patiëntspecifieke manier, waardoor het zPDX-model kan worden gebruikt in coklinische onderzoeken. Dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het maken van het zPDX-model, te beginnen met een stuk tumorresectie van de patiënt en het behandelen ervan om de respons op chemotherapie te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid heeft alle beschreven dierproeven goedgekeurd, in overeenstemming met richtlijn 2010/63/EU betreffende het gebruik en de verzorging van dieren. De lokale ethische commissie keurde de studie goed, onder registratienummer 70213. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokkenen. Voordat u begint, moeten alle oplossingen en de apparatuur worden voorbereid (sectie 1) en moeten de vissen worden gekruist (sectie 2).
1. Bereiding van oplossingen en apparatuur
OPMERKING: Zie tabel 1 voor de oplossingen en media die moeten worden voorbereid.
- Agarose gel ondersteuning
- Weeg het agarosepoeder af in een microwavable kolf en los het op in een bepaald volume E3 zebravismedium om een gel van 1% te maken. Verwarm in een magnetron totdat de agarose volledig is opgelost.
OPMERKING: Overkook de oplossing niet. - Giet de gesmolten agarose in een petrischaaltje en wacht tot de gel helemaal gestold is.
- Maak kleine agarose cilinders (~ 5 mm hoog) met behulp van een plastic Pasteur-pipet waarvan de punt is afgesneden. Eenmaal bereid, bewaren in een petrischaaltje bij 4 °C gewikkeld in aluminiumfolie.
- Weeg het agarosepoeder af in een microwavable kolf en los het op in een bepaald volume E3 zebravismedium om een gel van 1% te maken. Verwarm in een magnetron totdat de agarose volledig is opgelost.
- Glazen micronaalden
- Trek met een trekker aan de borosilicaatglazen haarvaten om fijne naalden te verkrijgen (instellingen: HEAT 990, PULL 550).
OPMERKING: Uit één capillair is het mogelijk om twee fijne naalden te verkrijgen met een puntdiameter van 10 μm.
- Trek met een trekker aan de borosilicaatglazen haarvaten om fijne naalden te verkrijgen (instellingen: HEAT 990, PULL 550).
2. Viskruising en eierverzameling
- Breng volwassen vissen 3 dagen voorafgaand aan weefselimplantatie over in kweektanks, zoals beschreven door Avdesh et al.17.
- OPMERKING: Een verhouding van 1:1 of 2:3 mannetjes tot vrouwtjes wordt aanbevolen. De visdichtheid moet maximaal vijf vissen per liter water zijn. Houd mannetjes en vrouwtjes 's nachts gescheiden met een barrière.
- Verwijder de volgende dag de barrière en laat de vis paren.
- Verwijder de vissen uit de kweektanks en breng ze terug naar hun huisvestingstanks.
- Giet het water uit de kweekbak door een fijnmazig net. Breng de bevruchte eieren over in een petrischaaltje met E3 zebravismedium.
- Controleer de petrischaal met een stereomicroscoop en gooi de troebele eieren weg. Bewaar de bevruchte eieren in vers E3 zebravismedium bij 28 °C.
3. Verzameling van specimens
OPMERKING: Autoclaaftang en een scalpelhandvat.
- Onmiddellijke verwerking
- Verzamel het chirurgische monster van de tumor in 10 ml tumormedium bij 4 °C (tumormonster met een diameter van 5 mm tot 10 mm). Breng het monster bij 4 °C over van de gewenste locatie voor onmiddellijke verwerking.
- Opslag 's nachts (optioneel)
- Verzamel het chirurgische tumormonster in 10 ml tumormedium en bewaar het monster 's nachts bij 4 °C.
- Opslag bij -80 °C (optioneel, minst aanbevolen)
- Bewaar het monster bij -80 °C in een cryogene injectieflacon met tumormedium aangevuld met 5% dimethylsulfoxide (DMSO).
4. Monsterverwerking
OPMERKING: Voer de stappen uit onder een steriele laminaire stromingskap voor weefselkweek.
- Was het hele tumorweefsel met 5 ml vers tumormedium en pipetteer 10x op en neer met een plastic Pasteur-pipet. Zuig het wasmiddel op en gooi het weg. Herhaal deze stap 3x.
OPMERKING: Vermijd aspiratie van het tumorweefsel omdat het aan de plastic Pasteur-pipet kan blijven zitten. - Breng het monster over in een petrischaaltje en dompel het onder in 1-2 ml vers tumormedium. Snijd het tumormonster in kleine stukjes (1-2 mm3) met behulp van een scalpelmesje en plaats ze in een steriele plastic buis van 5 ml met tumormedium.
- Stel de McIlwain weefselhakselaar in op 100 μm dikte. Leg de monsterfragmenten op de ronde plastic tafel van de hakselaar en hak ze fijn. Draai de tafel 90° en herhaal het hakken.
- Centrifugeer de fragmenten gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op en gooi het weg.
- Incubeer de fragmenten met een fluorescerende celtracker, CM-DiI (eindconcentratie van 10 μg/ml in dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing [DPBS]), Deep Red (eindconcentratie van 1 μL/ml in DPBS) of CellTrace (eindconcentratie van 5 μM in DPBS) gedurende 30 minuten, waarbij de buis in een waterbad van 37 °C wordt geplaatst.
- Resuspensie van de fragmenten door elke 10 minuten zachtjes op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Voeg in het geval van CellTrace aan het einde van de incubatie een medium toe dat ten minste 1% eiwit bevat, volgens de instructies van de fabrikant. - Centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap 3x met 1 ml DPBS om niet-geïncorporeerde kleurstof te verwijderen.
- Suspensie de fragmenten in 5 ml DPBS in een petrischaal van 60 mm.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel niet uitdroogt.
5. Oprichting van zPDX
OPMERKING: Voer de stappen uit onder een steriele laminaire stromingskap voor weefselkweek.
- Verdoof de 2 dagen na de bevruchting (dpf) embryo's met 0,16 mg/ml tricaïne in E3 zebravis medium.
- Plaats drie agarosecilinders (stap 1.1.3) in een petrischaaltje en leg een zebravisembryo op een cilinder, waarbij één kant wordt blootgelegd. Verwijder de overtollige oplossing om het embryo in slechts een dunne film te houden.
- Breng het stukje gekleurd weefsel met een steriele tang over van de petrischaal naar de 1% agarose-ondersteuning waar het embryo ligt. Pak het weefsel op, leg het bovenop de embryodooier en duw het vervolgens in de perivitellineruimte met behulp van de door warmte getrokken glazen micronaald (stap 1.2.1).
- Voeg voorzichtig enkele druppels E3 1% penicilline-streptomycine (Pen-Streptomycine) toe aan het embryo om het terug in de vloeistof te brengen.
- Herhaal stap 5.2-5.4 voor alle embryo's en verwijder ten slotte de agarosesteunen uit de petrischaal en incubeer de embryo's bij 35 °C.
- Controleer de embryo's op de juiste xenografts (positieve kleuring) 2 uur na implantatie met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop. Gooi de embryo's weg met tumorfragmenten die zich niet volledig in de perivitellineruimte bevinden, evenals de dode embryo's. Verdeel de embryo's willekeurig in zes multi-well platen (maximaal n = 20 embryo's/put), gelijkelijk verdeeld in groepen volgens het experimentele plan (bijv. controle en FOLFOXIRI).
6. Behandeling
- Verdun het geneesmiddel (bijv. 5-fluorouracil, oxaliplatine, irinotecan) tot E3 1% Pen-Strep, grondig mengen door meerdere keren op en neer te pipetteren. Zoals voorgesteld door Usai et al.12, gebruik een vijfvoudige verdunning van het geneesmiddel in het viswater, met betrekking tot de equivalente plasmaconcentratie (EPC).
- Meng de medicijnen om de cocktail te bereiden (bijv. FOLFOXIRI).
- Verwijder de media uit elke put en voeg de medicijncocktail 2 uur na implantatie toe.
- Behandel de embryo's gedurende 3 dagen. Vernieuw de drugscocktail elke dag.
7. Immunofluorescente kleuring met hele montage
OPMERKING: Breng aceton voor het begin aan bij -20 °C en bereid de in tabel 1 vermelde oplossingen.
- Dag 1:
- Bevestig de larven met 1 ml 4% paraformaldehyde in glazen injectieflacons bij 4 °C gedurende een nacht.
- Dag 2:
- Was de larven 3 x 5 minuten met 1 ml PBS, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).
- Bewaren in 1 ml 100% methanol bij -20 °C 's nachts (of voor langdurige opslag).
- Rehydrateer 3 x 10 min met 1 ml PTw (0,1% tween in PBS), zachtjes roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).
- Permeabiliseren met 1 ml van 150 mM Tris-HCl bij pH 8,8 gedurende 5 minuten bij RT, gevolgd door verwarming gedurende 15 minuten bij 70 °C.
- Was 2 x 10 minuten met 1 ml PTw, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).
- Was 2 x 5 minuten met 1 ml dH2O, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).
- Permeabiliseren met 1 ml ijskoude aceton gedurende 20 minuten bij -20 °C.
- Was 2 x 5 minuten met 1 ml dH2O, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatformwip (400 tpm).
- Was 2 x 5 minuten met 1 ml PTw, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).
- Incubeer de larven in 1 ml blokkeringsbuffer gedurende 3 uur bij 4 °C, voorzichtig roerend op een laboratoriumplatform rocker (400 rpm).
- Plaats de larven in putplaten die als volgt per groep zijn verdeeld: 10 larven in 50 μL volume/put in een 96-putplaat of 20 larven in 100 μL volume/put in een 48-putplaat.
- Gooi de blokkeringsbuffer weg, incubeer de larven met primaire antilichaamoplossing (bijv. Konijn anti-menselijke gekloofde caspase-3, 1:250) verdund in incubatiebuffer 's nachts bij 4 °C in het donker, en wieg zachtjes op een schudplaat (400 tpm). Zie stap 7.2.11 voor de aanbevolen volumes.
- Dag 3:
- Was de larven achtereenvolgens 3 x 1 uur met 1 ml PBS-TS (10% geitenserum, 1% Triton X-100 in PBS) en vervolgens met 2 x 10 minuten met 1 ml PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) en 2 x 1 uur met 1 ml PBS-TS. Roer bij elke wasbeurt de platen met de larven voorzichtig op een schudplaat (400 tpm).
- Incubeer de larven met fluorescerende kleurstof geconjugeerde secundaire antilichamen (bijv. Geit anti-Konijn IgG [H + L] Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647, 1:500) en 100 μg / ml Hoechst 33258 verdund in incubatiebuffer in het donker 's nachts bij 4 °C, met zachte agitatie op een schudplaat (400 rpm). Zie stap 7.2.11 voor de aanbevolen hoeveelheden secundaire antilichaamoplossing.
- Dag 4:
- Was 3 x 1 uur met 1 ml PBS-TS en 2 x 1 uur met 1 ml PTw, met zacht roeren op een schudplaat (400 tpm).
- Maak een cirkelvormige laag met het glazuur (dikte van ~ 0,5-1 mm) op microscoopglaasjes. Laat het glazuur uitdrogen en plaats de larven in het midden van de cirkelvormige laag, waardoor de zijkant van het xenograft bloot komt te liggen.
- Droog de overtollige oplossing en monteer de glazen afdekplaat met een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium.
8. Beeldvorming
- Leg beelden vast onder confocale microscopie met een 40x objectief. Gebruik de volgende acquisitieparameters: een resolutie van 1024 x 512 pixels met een Z-afstand van 5 μm.
9. Analyse van apoptose door ImageJ
- Laad (Fiji is gewoon) ImageJ-software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) en open de bestandsafbeelding van Z-stack (klik op Bestand | Open). Selecteer in het pop-upvenster Stackweergave/Hyperstack en klik op OK.
- Overlay de verschillende kanalen door Afbeelding | Kleur | Maak composiet.
- Sleep de Z-balk onder aan de afbeelding om door de Z-stack-afbeelding te bladeren en het xenograftgebied te identificeren (cellen die positief zijn voor fluorescerende celtrackers. Zie stap 4.5) in de perivitellineruimte van de zebravis.
- Selecteer Point Tool en tel het aantal apoptotische menselijke cellen (positieve tot fluorescerende celtracker en gespleten caspase-3), zoals weergegeven in Aanvullende video S1.
- Dubbelklik op het pictogram Point Tool , wijzig de teller en tel het totale aantal menselijke celkernen (kernen van CM-DiI-positieve cellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft de experimentele benadering voor het vaststellen van zPDX's van primair humaan pancreas adenocarcinoom. Een tumormonster werd verzameld, gehakt en gekleurd met behulp van fluorescerende kleurstof, zoals beschreven in protocolsectie 4. zPDX's werden vervolgens met succes vastgesteld door implantatie van een stuk tumor in de perivitellineruimte van 2 DPF-zebravisembryo's, zoals beschreven in protocolsectie 5. Zoals beschreven in protocolsectie 6, werden de zPDX's verder gescreend om de chemotherapiegevoeligheidsprofielen van van de patiënt afgeleide kankercellen te identificeren. De chemotherapiecombinatie FOLFOXIRI (5-fluorouracil, folinezuur, oxaliplatine en irinotecan) werd bijvoorbeeld getest, omdat het wordt gebruikt als de eerstelijnschemotherapie voor gevorderd pancreas ductaal adenocarcinoom en bij gemetastaseerde colorectale kanker. Whole-mount beelden van de zPDXs werden verkregen als Z-stacks op de confocale microscoop, en de apoptose-inductie werd geanalyseerd zoals beschreven in protocol secties 8 en 9. Zoals te zien is in figuur 1A,B, leidde de gecombineerde therapie tot een toename van celapoptose in vergelijking met de controlegroep. In de hier gerapporteerde casestudy werd een statistisch significante toename van de fractie apoptotische cellen in geïmplanteerde xenografts geïdentificeerd voor de met FOLFOXIRI behandelde groep in vergelijking met de controlegroep (figuur 1C).
| Figuur 1: zPDX's van humaan pancreas ductaal adenocarcinoom 3 dagen na behandeling met FOLFOXIRI. De celmembranen werden gekleurd met CM-DiI (rood) en het weefsel werd xenografeerd in de perivitellineruimte van 2 dpf AB wild-type zebravissen. Larven werden blootgesteld aan een FOLFOXIRI-combinatie (0,216 mg / ml 5-fluorouracil, 0,013 mg / ml folinezuur, 0,006 mg / ml oxaliplatine, 0,011 mg / ml irinotecan) of niet blootgesteld (CTRL) gedurende 3 dagen, gefixeerd en immunogekleurd met gespleten caspase-3-antilichaam (cyaan) en tegengekleurd door Hoechst (blauwe kernen). Larven werden gemonteerd met Aqua Poly-Mount in glazen microscoopglaasjes. (A1-3) Representatief voorbeeld van een controlelarve (niet blootgesteld aan chemotherapie). Er werden geen gespleten caspase-3-positieve cellen waargenomen. (B1-3) Representatief voorbeeld van een xenogetransplanteerde larve 3 dagen na behandeling met FOLFOXIRI, die consistente activering van gekloofd caspase-3 laat zien. Beelden met hele vatting zijn gemaakt met een Nikon A1 confocale microscoop met een digitale camera. De stippellijnen tonen de xenograft gebieden. (C) Kwantificering van gekloofde caspase-3 en CM-DiI dubbelpositieve cellen in xenogetransplanteerde larven behandeld met FOLFOXIRI in vergelijking met CTRL, uitgezet als gemiddelde ± SEM (n ≥ 12); p < 0,001, Mann-Whitney U-test. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: zPDX = zebravis patiënt-afgeleid xenograft; DPF = dagen na de bevruchting; FOLFOXIRI = 5-fluorouracil, folinezuur, oxaliplatine en irinotecan; CTRL = controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. |
| Oplossing/medium | Samenstelling, opmerkingen | Doel | ||
| Tumor medium (1x) | Voeg aan RPMI-1640 medium penicilline-streptomycine (eindconcentratie 100 E/ml) en amfotericine (eindconcentratie 2,50 μg/ml) toe. | |||
| E3 zebravis medium (1x) | Verdun het 60x E3 embryomedium (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke werkconcentratie van 1x. | |||
| E3 1% Pen-Strep | Voeg 1 ml penicilline-streptomycine toe aan 99 ml E3 zebravismedium. Meng door inversie. Bewaar de oplossing bij 4 °C | |||
| Ptw | 0,1% Tween in PBS | Immunokleuring met hele montuur | ||
| Buffer blokkeren | 10% geitenserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 in PTw | Immunokleuring met hele montuur | ||
| Incubatiebuffer | 1% geitenserum, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 in PTw | Immunokleuring met hele montuur | ||
| Pbs-TS | 10% geitenserum, 1% Triton X-100 in PBS | Immunokleuring met hele montuur | ||
| Pbs-T | 1% Triton X-100 in PBS | Immunokleuring met hele montuur | ||
Tabel 1: Oplossingen en media die in het protocol worden gebruikt.
Aanvullende figuur S1: PDAC-tumormonster was DiO-gekleurd (groen) en xenogegrafeerd in de perivitellineruimte van 2 dpf-zebravisembryo's. Na een incubatietijd van 3 dagen werden zPDX's geïnjecteerd met 2 μg / ml propidiumjodide (PI; rood) en vervolgens onderworpen aan 3D-confocale beeldvorming. De levensvatbaarheid van de cel werd gecontroleerd door PI-positieve cellen te meten uit het totale aantal menselijke cellen (DiO-positief). Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: PDAC = ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier; DPF = dagen na de bevruchting; zPDX = zebravis patiënt-afgeleid xenograft. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video S1: Voorbeeld van het tellen van apoptotische menselijke cellen, met behulp van het meerpuntsgereedschap van ImageJ. De video is een Z-stack van een zPDX 3 dagen na implantatie, verkregen na gekloofde caspase-3 en Hoechst 33258 immunostaining. Afkortingen: zPDX = zebravis patiënt-afgeleid xenograft. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo modellen in kankeronderzoek bieden onschatbare hulpmiddelen om kankerbiologie te begrijpen en de respons op kankerbehandeling te voorspellen. Momenteel zijn er verschillende in vivo modellen beschikbaar, bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde dieren (transgene en knock-out muizen) of van patiënten afgeleide xenografts uit menselijke primaire cellen. Ondanks vele optimale functies, heeft elk ervan verschillende beperkingen. In het bijzonder missen de bovengenoemde modellen een betrouwbare manier om de micro-omgeving van het tumorweefsel van de patiënt na te bootsen.
Er is gesuggereerd dat de micro-omgeving van de tumor veel belangrijke rollen kan spelen bij de respons op geneesmiddelen18. Om een geschikt diermodel te vinden dat de micro-omgeving van het tumorweefsel onderhoudt, werd daarom een alternatief PDX-model ontwikkeld, met behulp van stukjes tumorweefsel xenografeerd in 2 dpf zebravisembryo's. Het protocol beschrijft hoe xenografts in een groot aantal embryo's moeten worden uitgevoerd, waardoor de high-throughput screening van geneesmiddelen mogelijk is, zowel als afzonderlijke middelen als in combinaties.
Het belangrijkste punt van deze innovatieve aanpak is dat het zowel cel-celinteracties als de tumormicro-omgeving behoudt, vergeleken met de vaak uitgevoerde zPDX's met eencellige suspensies. De PDAC van een chirurgisch monster wordt onmiddellijk in verse en koude tumormedia geplaatst en de tumor wordt in kleine fragmenten gehakt. De algemene procedure die wordt gebruikt om het zPDX-model te genereren, is gebaseerd op de directe implantatie van een fragment van de tumor van een patiënt in de perivitellineruimte van een 2 dpf-zebravisembryo.
Het voorgestelde model zou kunnen dienen als een alternatief voor het PDX-model op basis van de vertering van het van de patiënt afgeleide tumorweefselmonster, gevolgd door directe injectie in de dooierzak of in de perivitellineruimte. Zoals blijkt uit het werk van Fior et al., is het mogelijk om een zAvatar-model vast te stellen uit de enzymatische dissectie van chirurgisch gereseceerde pancreatobilaire kankers. De implantatiesnelheid varieerde tussen 44% en 64%, vanwege de typische lage cellulariteit van het tumorpancreasmonster en het ongunstige dichte desmoplastische stroma19.
De celsuspensie reproduceerde echter slechts gedeeltelijk de oorspronkelijke tumor14. Omgekeerd lijkt de mPDX, geconstrueerd door tumorweefsel rechtstreeks te transplanteren in immunodeficiënte muizen, het beste op de oorspronkelijke tumor, wat clinici beter kan helpen tumorgedrag te begrijpen en individuele reacties voorafgaand aan de behandeling te evalueren20. In feite onderhoudt het kleine, geënte fragment de micro-omgeving van de tumor en behoudt het de kruisverwijzing tussen kwaadaardige en gezonde cellen, vergelijkbaar met de oorspronkelijke tumor21. De chemosensitiviteit of chemoresistantie wordt dus beter gereproduceerd, met een directe impact van zPDX-technologie op het gebied van translationele oncologie14. De zPDX-aanpak stelt elke patiënt in staat om zijn eigen tumor te laten ontwikkelen in een levend systeem. Dit is dus een goed alternatief voor het gebruik van mPDX, waarbij het tumorweefsel intact wordt georthografeerd of gedesaggregeerd in cellen, die vervolgens worden xenografeerd in muisontvangermodellen13.
Dit protocol is ontwikkeld in samenwerking met pathologen die verantwoordelijk zijn voor het selecteren van de meest geschikte tumorstukken voor transplantatie. Biologische weefselmonsters zijn altijd genomen van het chirurgische monster en nooit van een biopsie, omdat deze laatste meestal wordt gekenmerkt door een schaarste aan weefsel en daarom alleen voor diagnostische doeleinden is bestemd. Het criterium voor weefselbemonstering is meestal niet marginaal versus kern, maar eerder een tumorgebied dat verstoken is van bloeding en necrose. Om deze reden werd altijd een cryostaat histologische sectie uitgevoerd op de helft van het monster voor onmiddellijke kwaliteitscontrole van het materiaal. De huidige studie zou kunnen worden beperkt door de capaciteit van de primaire tumorcellen om te enten in de perivitellineruimte van zebravisembryo's. Echter, een 80% engraftment rate van levensvatbaar weefsel werd waargenomen 3 dagen na transplantatie, zowel na opslag bij 4 °C (12/15 gevallen) als ontdooid vanaf -80 °C (10/12 gevallen), wat suggereert dat de tumor effectief kan worden gecryopreserveerd, met een cel levensvatbaarheid van 74% ± 2% (aanvullende figuur S1). Desondanks varieert het succespercentage van weefseltransplantatie tussen verschillende PDAC-patiënttumoren; Bijgevolg kan de snelle verwerking van het weefsel kort na de chirurgische resectie, evenals het voorkomen van bevriezing, de efficiëntie verbeteren.
Enkele technische hulpmiddelen worden ook voorgesteld in het protocol voor succesvolle xenografts. Zo heeft het gebruik van de hakselaar de afmetingen van de xenogetransplanteerde stukken gestandaardiseerd. Om te controleren of de stukjes tumorweefsel na het hakken even groot zijn, is een mogelijke oplossing om een kalibratieglas te gebruiken om de diameter van de fragmenten te meten vóór xenotransplantatie.
Het gebruik van de 1% agarose cilindersteun is essentieel voor zowel het leggen van de embryo's aan één kant als het eenvoudig implanteren van een stuk tumor, evenals om te voorkomen dat de micronaald breekt. Omdat tumoren een hoge variabiliteit vertonen, is een andere beperking van de methode dat de intratumorale heterogeniteit minder vertegenwoordigd is in een fragment in vergelijking met een cellulaire suspensie. In feite kunnen kleine stukjes weefsel divergeren in termen van goedaardige celpopulaties en tumorsubklonen. Om deze kritiek te overwinnen, moet een groot aantal geïnjecteerde embryo's worden gebruikt om de heterogeniteit van de tumor samen te vatten en de variabiliteit in de analyse te verminderen. Volgens de statistische analyse vereist elke groep een steekproefgrootte groter dan 15, rekening houdend met een effectgrootte van d = 2 en een macht van 80% en 95% statistische significantie. Dit aantal is redelijk, omdat een deskundige operator ongeveer 40 embryo's per uur kan verwerken.
Naast de methodologie die werd gebruikt om het zPDX-model te genereren, werd hier ook aangetoond dat een FOLFOXIRI-combinatie apoptose induceert van patiënt-afgeleide cellen in het zPDX-model. Net als bij FOLFOXIRI is het mogelijk om de zPDX-chemosensitiviteit te testen voor andere chemotherapieschema's, zoals die met succes zijn getest door Usai et al.11.
Daarnaast wordt de techniek van whole-mount immunostaining en imaging gepresenteerd om de kwantificering van het kenmerk van belang te bieden. Om sommige problemen te overwinnen en te leiden tot succesvolle immunostaining van de hele mount, wordt een 5% DMSO-oplossing aanbevolen om de weefsels te permeabiliseren. Wat de confocale beeldvorming betreft, kunnen de resolutiebeperkingen van de confocale microscoop de verwerving van de diepere stapels van de xenogetransplanteerde larven belemmeren. In de studie worden de apoptotische cellen echter geteld uit het totale aantal patiëntcellen. Een driedimensionale reconstructie van de basis tot de bovenkant van de geïmplanteerde tumormassa, met een stapgrootte van 5 μm, maakt het mogelijk om alle menselijke kernen te identificeren, rekening houdend met de waarschijnlijkheid dat dezelfde kern zich binnen het vorige of volgende Z-vlak kan verspreiden. Bijgevolg kan de ImageJ multi-point tool counter worden gebruikt om het tellen van dezelfde cel twee keer te controleren en te voorkomen en om dubbeltelling uit te voeren in dezelfde Z-stacks (apoptotisch uit totale menselijke cellen) en kan apoptose gemakkelijk worden getraceerd op het niveau van één cel.
Ondanks zijn beperkingen heeft het zPDX-model verschillende voordelen ten opzichte van in vivo modellen: de extreem snelle levenscyclus van zebravissen, het kunnen verkrijgen van grote aantallen dieren in korte tijd; de optische helderheid in de ontwikkelingsfasen; en vooral de extreem lage ethische impact in het 0-120 h post fertilisatie tijdvenster22. Tegenwoordig is een coklinisch onderzoek met zPDX's goedkoper dan dat met op muizen gebaseerde PDX's, omdat immunodeficiënte gastheerstammen hoge onderhoudskosten en complexe beeldvormingsmethoden vereisen om tumorgroei te volgen23. Kortom, al deze factoren benadrukken het potentieel van het zPDX-model voor gebruik in coklinische onderzoeken voor het voorspellen van de chemotherapiegevoeligheidsprofielen van kankerpatiënten en voor gebruik door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nieuwe modellen voor geneesmiddelenscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Fondazione Pisa (project 114/16). De auteurs willen Raffaele Gaeta van de Histopathologie Unit van Azienda Ospedaliera Pisana bedanken voor de selectie van patiëntenmonsters en pathologieondersteuning. We bedanken ook Alessia Galante voor de technische ondersteuning bij de experimenten. Dit artikel is gebaseerd op werk van COST Action TRANSPAN, CA21116, ondersteund door COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
