I tråd med det presserende behovet for screening for type 1 diabetes, cøliaki og koronavirussykdom 2019, utviklet vi en høy gjennomstrømning 6-Plex elektrokjemiluminescensanalyse for samtidig å oppdage alle fire øyautoantistoffer, vevstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mot reseptorbindingsdomenet for alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2.
En pågående klinisk studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningstudien i befolkningen for type 1 diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er det presserende behov for epidemiologien til COVID-19 i befolkningen generelt og kunnskap om sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og T1D-utvikling. Den nåværende standard screeningmetoden for radiobindingsanalysen (RBA) har møtt to store utfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sykdomsspesifisitet med en stor andel lavaffinitetsantistoffer generert i screening. Med plattformen til multiplekselektrokjemiluminescensanalysen (ECL) vi etablerte tidligere, ble det utviklet en ny 6-Plex ECL-analyse som kombinerer, i en enkelt brønn, alle fire holme autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyredekarboksylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og sinktransportør 8 (ZnT8) for T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) for cøliaki og alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) reseptorbindende domene (RBD) antistoffer for COVID-19. Analysen ble validert i blinde ved hjelp av 880 prøver fra ASK-studien, inkludert 325 positive prøver og 555 alle antistoffnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA og en enkelt ECL-analyse. Med fordelene med høy effektivitet, lave kostnader og lavt serumvolum har denne analysen blitt akseptert som det primære screeningverktøyet for ASK-studien.
Store epidemiologiske studier over hele verden viser at forekomsten av type 1 diabetes (T1D) har økt raskt med 3% -5% årlig, og forekomsten av T1D har doblet seg de siste 20 årene, spesielt hos små barn 1,2. Islet autoantistoffer (IAbs) vises vanligvis år før kliniske symptomer og er for tiden de mest pålitelige prediktive og diagnostiske biomarkørene for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identifisere personer i fare for å utvikle seg til klinisk T1D, utdanne publikum, i stor grad redusere livstruende komplikasjon av ketoacidose og dra nytte av kliniske studier for forebyggende terapier. Verdensomspennende forebyggende innsats for T1D pågår, og flere intervensjonsforsøk utføres blant personer med IAbs positive for å forsinke progresjonen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lanserte den første amerikanske kliniske studien av screening i befolkningen generelt i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sykdom relatert til immun og genetiske faktorer. Utbredelsen av CD hos barn med T1D kan nå opptil 24,5%5. Mer enn halvparten av personer med CD kan ikke ha typiske symptomer ved presentasjon6, så serologisk screening for cøliaki er ganske nødvendig.
Siden pandemien med koronavirussykdom 2019 (COVID-19) startet, har over 200 millioner tilfeller blitt rapportert globalt, og barn står for opptil 16% av laboratoriebekreftede tilfeller7. Mange studier har vist virkningen av eksisterende T1D på alvorlighetsgraden og dødsfallet av COVID-19-infeksjon8, mens virkningen av COVID-19-infeksjon på T1D-utvikling ikke er klar. Undersøkelsen av den totale frekvensen av COVID-19-infeksjon i befolkningen generelt ved bestemmelse av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og studien av sammenhengen mellom COVID-19-infeksjon og utløsende T1D-autoimmunitet eller akselererende T1D-progresjon er presserende og svært viktig, mens den pågående ASK-studien er en utmerket plattform for dette. På grunn av enkeltanalyseformatet og genereringen av en stor andel av antistoffpositivitet med lav affinitet, har standard radiobindende analyse (RBA) møtt en flaskehals med lav effektivitet og lav sykdomsspesifisitet9. I dette papiret presenterer vi en ny 6-plexed elektrokjemiluminescens (ECL) analyse bygget på vår forrige multiplex ECL-analyseplattform ved hjelp av en multiple-Plex-plate, som kombinerer seks autoantistoffanalyser i en enkelt brønn, inkludert alle fire store IAbs til insulin (IAA), glutaminsyredekarboksylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og sinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer mot transglutaminase (TGA) for cøliaki, og SARS-CoV-2 reseptorbindende domene (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er den første multipleksanalysen som rekrutterte et komplett panel på fire store IAb-er og videre kombinerte dette med TGA og COVID-19A. Det er validert og formelt akseptert som det primære screeningverktøyet som erstatter standard RBA i ASK-studien.
Intervensjonen for T1D har gått inn i pre-T1D-æraen, med pågående nasjonale og internasjonale storskala screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske studier som brukes i trinn 1 T1D for å oppheve eller bremse progresjonen til kliniskT1D 12,13. Målinger av fire IAb-er ved bruk av gjeldende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er arbeidskrevende og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende etterspørselen etter en multiplekset IAbs-analyse med høy gjennomstrømning, har multiplekset ECL-analyse, 3-Screen ICA ELISA og antistoffdeteksjon ved agglutinerings-PCR (ADAP) dukket opp som for tiden konkurransedyktige teknologier. I Fr1da-studien av screening for T1D i en populasjon av små barn i Tyskland, ble 3-Screen ICA ELISA kombinere 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) brukt som hovedtest14. En stor begrensning av 3-Screen ICA ELISA er mangelen på IAA, som for det meste er den første IAb som vises med høy prevalens hos små barn med T1D. Videre er analysen ikke i stand til å skille hvilken av de tre IAbene som er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve må gjentas med tre enkeltanalyser for bekreftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerte høy analysefølsomhet og spesifisitet i IASP-verkstedet, men mangler data om hvor prediktivt det er i populasjonsbasert screening for T1D-studier, som IASP-verkstedet ikke er i stand til å bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne studien er bygget på plattformen av en enkelt ECL-analyse som er validert mot gjeldende standard RBA i flere kliniske studier som TrailNet 9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Den foreliggende analysen er validert mot både RBA- og enkelt-ECL-analyse ved bruk av 880 serumprøver fra deltakerne i ASK-studien. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistoffnivåer mellom 6-plex og enkelt ECL eller mellom 6-plex og RBA for det meste kongruente med hverandre for positiviteten til antistoffer. Tilfeldighetsratene for IAbs testet av RBA og 6-Plex var 91,7% -97,8%, og tilfeldighetsratene for IAbs testet av enkelt ECL og 6-Plex var 95,3% -99,2%. Uenighet mellom ECL-analysen og RBA var hovedsakelig fra de med enkelt IAb. Nivåene av IAbs testet av 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korrelert. TGA testet med 6-plex analyse var sterkt korrelert med resultatene av både RBA (99,4 %) og enkelt ECL-analyse (99,4 %). I tillegg oppnådde COVID-19A testet av 6-Plex 99,8 % samsvar med resultatene av den enkle ECL-analysen.
Som et resultat har 6-Plex ECL-analysen formelt blitt akseptert som den primære screeningmetoden for den pågående ASK-studien og erstattet standarden RBA22. Denne analysen viste sin utmerkede følsomhet og spesifisitet med høyere gjennomstrømning, lavere kostnader og mindre volum serum sammenlignet med standard RBA.
Det er dokumentert at i T1D-screeningstudien var enkelt IAb oppdaget av RBA, som tok opp en stor andel av IAb-positiviteter, av lav affinitet, med lav sykdomsrisiko, og resulterte i samlet lav prediktiv verdi 19,21,23,24,25,26. Slike lav risiko prediksjon forårsaket store ekstra kostnader for oppfølgingsbesøk og resulterte i vanskeligheter for T1D forebyggende studier. Den etablerte ECL-analyseplattformen har blitt demonstrert i flere kliniske studier for å diskriminere IAb-er med høy affinitet fra IAb-er med lav affinitet generert av RBA og forbedre de prediktive verdiene for alle fire IAb-ene, spesielt med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien ble bygget på plattformen til den enkle ECL-analysen, med denne distinkte fordelen med deteksjon av abs med høy affinitet. I denne studien illustrerte 6-Plex ECL-analysen dens likhet med de tilsvarende enkelt-ECL-analysene i sensitivitet og spesifisitet.
Noen begrensninger og de tekniske bekymringene til multipleks-ECL-analysen ved bruk av flere Plex-plater er allerede dekket i tidligere publikasjoner27,28. Med seks merkede antigener i en brønn kan det være noen påvirkninger mellom forskjellige antigener, og analysebakgrunnen kan øke når man legger til hver antistoffanalyse for multipleksing i samme brønn. En stor mengde analyseoptimaliseringsarbeid er nødvendig for å justere analysebetingelsene, spesielt for å justere de endelige konsentrasjonene av hvert merket antigenprotein basert på sjakkbrettanalysen for hvert antigen, for å opprettholde følsomheten og spesifisiteten for hver antistoffanalyse. Som nevnt i tidligere studier27,28, resulterer et lite antall prøver (<1%) i falsk positivitet på flere Plex-plater uten en klar underliggende årsak. Alle positive resultater bør gjentas og bekreftes med en enkelt ECL-analyse som rutinemessig laboratoriekvalitetssikring; Vanligvis vil de falske positivene bli fjernet. Falske negative resultater forårsaket av "prozoneffekten" observert i den forrige 7-Plex ECL-analysen27,28 ble ikke observert i denne studien. I analysen beskrevet her fjernet vi trinnet i syrebehandlingen av serumprøver fra forrige protokoll; i stedet forvarmet vi serumprøvene ved 56 °C i 30 minutter (trinn 5.1.). På den andre dagen av platevask brukte vi en vaskebuffer som inneholdt 0,4 M NaCl (trinn 8,1.) i stedet for vanlig vaskebuffer for å vaske platen strengere. Disse modifikasjonene gjorde multipleksen ECL-analysen enklere og senket bakgrunnen uten å miste analysefølsomheten.
Avslutningsvis har denne analysen enestående ytelse for å oppdage fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidig. Multipleksingsfunksjonen, samt høy gjennomstrømning, lave kostnader og lite serumvolumkrav, gjør storskala screening for T1D og samtidige sykdommer mye mer gjennomførbart i befolkningen generelt. Pasienter med T1D eller noen autoimmune sykdommer har en mye høyere risiko for andre autoimmune sykdommer. Multiplex ECL-analysen gir en utmerket plattform for å skjerme for T1D og flere autoimmune sykdommer samtidig.
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av JDRF-stipend 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-stipend DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) stipend P30 DK116073.
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |