侵害受容器ニューロンとNK細胞は、炎症性の状況において活発に相互作用する。共同文化アプローチは、この相互作用を研究することを可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
体性感覚ニューロンは、有害な刺激を検出し、防御反射を活性化するように進化してきました。侵害受容器ニューロンは、コミュニケーション手段を共有することにより、免疫系の活動を制御することによって宿主防御も調整します。これらのシステム間の通信は主に適応的であり、恒常性を保護するのに役立ち、慢性疾患の発症につながるか、または促進する可能性もあります。両方のシステムは、一次および二次リンパ組織および粘膜に見られるような局所相互作用を可能にするために共進化した。最近の研究では、侵害受容器が外来抗原、免疫細胞由来サイトカイン、および微生物を直接検出して応答することが実証されています。
侵害受容器の活性化は、疼痛過敏症およびかゆみをもたらすだけでなく、侵害受容器発火閾値を低下させ、神経ペプチドの局所放出をもたらす。侵害受容器の末梢末端によって産生され、そこから放出されるペプチドは、リンパ球の走化性および分極をブロックし、炎症の局在、持続時間、およびタイプを制御することができる。最近の証拠は、感覚ニューロンが細胞間接触 を介して 自然免疫細胞と相互作用し、例えばナチュラルキラー(NK)細胞上のグループ2D(NKG2D)受容体に関与することを示しています。
NK細胞が様々な侵害受容器産生メディエーターの同族受容体を発現していることを考えると、侵害受容器は神経ペプチドを用いてNK細胞の活性を制御していると考えられます。ここでは、ディッシュ中で侵害受容器ニューロン-NK細胞の相互作用を研究するための共培養法を考案します。このアプローチを用いて、腰椎侵害受容器ニューロンがNK細胞のサイトカイン発現を低下させることを見出しました。全体として、このような還元主義的方法は、腫瘍神経支配ニューロンがNK細胞の抗癌機能をどのように制御するか、およびNK細胞が損傷ニューロンの排除をどのように制御するかを研究するのに役立つ可能性があります。
概要
感覚ニューロンの細胞体は、後根神経節(DRG)に由来します。DRGは、脊髄の背角と末梢神経終末の間の末梢神経系(PNS)に位置しています。DRGニューロンの擬似単極性は、標的組織を神経支配する末梢枝から、体性感覚情報を脊髄に運ぶ中心枝への情報の伝達を可能にする1。特殊なイオンチャネル受容体を使用して、一次ニューロンは病原体、アレルゲン、汚染物質2によってもたらされる脅威を感知し、陽イオン(Na+、Ca2+)の流入と活動電位3,4,5の生成につながります。
これらのニューロンはまた、最初の危険感知が起こった末梢に向かってアンチドロミック活動電位を送り、それが神経ペプチドの局所放出をもたらす1,4。したがって、侵害受容器ニューロンは保護メカニズムとして機能し、宿主に環境の危険を警告します4,5,6,7
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プロトコル
モントリオール大学の施設動物管理および使用委員会(#22053、#22054)は、すべての動物の手順を承認しました。溶液とその組成のリストについては表 1 を、このプロトコルで使用される材料、機器、および試薬のリストについては 材料表 を参照してください。
1. NK細胞の単離、培養、刺激
- 侵害受容器ニューロンを無傷で生成する(同腹仔制御;ロックストップロックス-ジフテリア毒素マウス(DTA fl/fl)とTRPV1cre/wtマウスを交配することにより、TRPV1 wt::D TAfl/wt)およびアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。
- CO2吸入を使用して、ナイーブ同腹仔対照(TRPV1 wt::D TAfl / wt)マウスを安楽死させます。
- 500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む1.5 mLの微量遠心チューブで脾臓を収集します。
- 乳棒を使用して脾臓を均質化します。
- 細胞を1 mLの滅菌PBSで希釈します。
- 混合物を....
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結果
NK細胞をリターメイトコントロール(TRPV1wt::D TAfl/wt)マウス脾細胞から磁気精製し、IL-2およびIL-15で刺激(48時間)しました。次いで、NK細胞を単独で培養するか、侵害受容器ニューロンから採取したDRGニューロンと無傷で共培養した(同腹仔対照;TRPV1wt::D TAfl/wt)またはアブレーション(TRPV1cre::D TAfl/wt)マウス。次いで、細胞をTRPV1アゴニストカプサイシン(1μM)またはそのビヒクルに曝露した。共培養の24時間後、NK細胞をFACS精製し、フローサイトメトリーを用いてそれらの活性化レベルを免疫表現型決定した(図1A)。
単独で培養した場合、NK細胞はGM-CSFおよびNKp46の基礎レベルを発現した。侵害受容器から採取したDRGニューロンと共培養した場合(TRPV1wt::D TAfl/wt
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ディスカッション
Daviesら11 は、損傷したニューロンがRAE1をアップレギュレートすることを発見した。その後、細胞間接触 を介して 、NKG2D発現NK細胞はRAE1+ ニューロンを同定して排除することができ、それが慢性疼痛を制限しました11。NK細胞も様々な神経ペプチド受容体を発現しており、その免疫調節能が知られていることから、NK細胞と侵害受容器神経細胞との相互作用を in vitroで研究することがますます重要になっていると考えられます。ここでは、ニューロンがNK細胞の機能をどのように制御し、NK細胞がDRGニューロンの機能をどのように調節できるかを相互に研究できる簡単な共培養プロトコルを考案しました。フローサイトメトリーは、ニューロンがNK細胞の活性化をどのように調節するかを免疫表現型決定するために使用されました。あるいは、研究者はqPCRまたはRNAシーケンシングを使用して、FACS精製細胞の転写産物の変化を測定したり、ELISAを使用してサイトカインや神経ペプチドなどの分泌因子の分泌.......
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
この研究は、研究基金のニューフロンティア(NFRFE201901326)、カナダ健康研究所(162211、461274、461275)、カナダイノベーション財団(37439)、カナダ研究委員長プログラム(950-231859)、カナダ自然科学工学研究評議会(RGPIN-2019-06824)、およびケベック自然と技術財団(253380)によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗マウスCD16/32 | クソン研究所 | 猫番号:017769 | |
| B-27 | ジャクソン研究所 | 猫番号:009669 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA)培養グレード | ワールド精密機器 | 猫番号:504167 | |
| BV421 抗マウスNK-1.1 | フィッシャーサイエンティフィック | カタログ番号:12430112 | |
| セルストレーナー(50 μm) | フィッシャーサイエンティフィ | 猫番号:A3160702 | |
| コラゲナーゼIV | フィッシャーサイエンティフィ | 猫番号:15140148 | |
| ジフテリア毒素fl/fl | フィッシャーサイエンティフィ | 猫番号:SH3057402 | |
| II | フィッシャーサイエンティフィック | 猫番号:13-678-20B | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM) | フィッシャーサイエンティフィック | 猫番号:07-200-95 | |
| EasySepマウスNK細胞単離キット | シグマ | 猫番号:CLS2595 | |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA) | シグマ | 猫番号:C0130 | |
| FACSAria III | シグマ | 猫番号:04942078001 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | シグマ | 猫番号:806552 | |
| FITC抗マウスNKp46 | シグマ | 猫番号:L2020 | |
| 平底96ウェルプレート | シグマ | 猫番号:03690 | |
| ガラスパスツールピペット | シグマ | 猫番号:470236-274 | |
| グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF) | VWR | 猫番号:02-0131 | |
| ラミニン | シダーラン | 猫番号:03-50/31 | |
| L-グルタミン | ギブコ | 猫番号:A14867-01 | |
| マウス組換えIL-15 | Gibco | カタログ番号:22400-089 | |
| マウス組換えIL-2 | Gibco | カタログ番号:21103-049 | |
| 神経成長因子(NGF) | Life Technologies | カタログ番号:13257-019 | |
| 神経基礎培 | PeproTech | カタログ番号:450-51-10 | |
| PE抗マウスGM-CSF | PeproTech | カタログ番号:212-12 | |
| ペニシリンとStreptomycin | PeproTech | カタログ番号:210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | カタログ番号:19855 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | Biolegend | カタログ番号:108732 | クローンPK136 |
| RPMI 1640 media | バイオレジェンド | 番号:137606 | クローン29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | カタログ番号:505406 | クローンMP1-22E9 |
| ピンセットと解剖ツール。 | バイオレジェンド | カタログ番号:65-0865-14 | |
| U字型ボトム96ウェルプレート | バイオレジェンド | カタログ番号:101319 | |
| 生存率 染料 eFlour-780 | ベクトン・ディキンソン |
参考文献
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al.
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再版と許可
