通过叶绿素荧光分析评估光呼吸突变体的光合效率
Summary
我们描述了一种使用叶绿素荧光测量低CO2 处理后植物光合效率变化的方法。
Abstract
光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量，是植物生存所必需的。几十年来，许多对光合作用和光呼吸很重要的酶和基因已经得到了很好的研究，但这些生化途径的某些方面及其与几个亚细胞过程的串扰尚未完全了解。许多确定植物代谢中重要基因和蛋白质的工作都是在高度受控的环境中进行的，这些环境可能无法最好地代表自然和农业环境中的光合作用和光呼吸功能。考虑到非生物胁迫导致光合作用效率受损，有必要开发一种可以监测非生物胁迫及其对光合作用影响的高通量屏幕。
因此，我们开发了一种相对快速的方法来筛选非生物胁迫诱导的光合效率变化，该方法可以使用叶绿素荧光分析和低CO2 筛选来识别在光呼吸中起作用的未表征基因。本文描述了一种研究 拟南芥中转移的DNA（T-DNA）敲除突变体光合效率变化的方法。相同的方法可用于筛选甲磺酸乙酯（EMS）诱导的突变体或抑制因子筛选。利用该方法可以鉴定候选基因，以进一步研究植物初级代谢和非生物胁迫反应。来自这种方法的数据可以深入了解基因功能，直到暴露于增加的压力环境之前可能无法识别。
Introduction
农民田间常见的非生物胁迫条件会降低光合效率，从而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐度等有害环境条件会导致非生物胁迫，从而改变 CO2 的可用性并降低植物对高光胁迫的反应。两个最大的陆地碳通量是光合作用和光呼吸，这对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下进行了表征，并在遗传水平上进行了鉴定1。尽管在了解光合作用和光呼吸方面取得了很大进展，但许多步骤，包括植物细胞器之间的运输，仍未表征2，3。
光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当Rubisco酶将氧气而不是二氧化碳固定到核酮糖1，5二磷酸（RuBP）上，产生抑制性化合物2-磷酸乙醇酸酯（2PG）1时开始。为了尽量减少2PG的抑制作用并回收先前固定的碳，C3植物已经进化出光呼吸的多器官过程。光呼吸将两个2PG分子转化为一个3-磷酸甘油酸（3PGA）分子，可以重新进入C3固碳循环1。因此，光呼吸仅从2PG的产生中转换了先前固定碳的75%，并在此过程中消耗了ATP。因此，光呼吸过程对光合作用过程有10%-50%的显着拖累，具体取决于水分的可用性和生长季节的温度4。
几十年来，参与光呼吸的酶一直是研究重点领域，但只有少数转运蛋白在遗传水平上被表征，尽管该过程至少涉及25个转运步骤5，6，7。直接参与光呼吸过程中产生的碳运动的两种转运蛋白是乙醇酸质体/甘油酸酯转运蛋白PLGG1和胆汁酸钠共转运蛋白BASS6，两者都参与从叶绿体5，6输出乙醇酸。
在环境温度[CO2]下，Rubisco将氧分子固定在RuBP上的时间约为20%1。当植物受到低[CO 2]时，光呼吸速率增加，使低[CO2]成为测试突变体的理想环境，这些突变体在升高的光呼吸胁迫下可能很重要。在低CO2下测试其他假定的叶绿体转运蛋白T-DNA系24小时并测量叶绿素荧光的变化导致鉴定出显示光呼吸突变表型5的bass6-1植物系。进一步表征表明BASS6是叶绿体内膜中的乙醇酸酯转运蛋白。
本文详细描述了一种类似于最初用于将BASS6鉴定为光呼吸转运蛋白的方案，该方案来自位于叶绿体膜内的 假定转运蛋白列表8该协议可用于表征拟南芥T-DNA突变体或EMS生成的突变植物的高通量实验，作为鉴定在一系列非生物胁迫（例如热）下维持光合作用效率的重要基因的一种方式， 高光胁迫、干旱和 CO2 可用性。过去曾使用叶绿素荧光筛选植物突变体来快速鉴定对初级代谢很重要的基因9。由于多达30%的拟南芥基因组包含编码功能未知或表征不佳的蛋白质的基因，胁迫诱导的光合效率分析可以提供在突变植物受控条件下未观察到的分子功能的见解10。该方法的目标是使用低CO2 筛选来鉴定光呼吸途径的突变体。我们提出了一种方法来识别暴露于低CO2后破坏光呼吸的突变体。这种方法的一个优点是，它是可以在相对较短的时间内完成的幼苗的高通量筛选。视频协议部分详细介绍了种子制备和灭菌、植物生长和低 CO2 处理、荧光成像系统的配置、处理样品的量子产率测量、代表性结果和结论。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文概述的实验方法具有一些优点和局限性。一个优点是这种方法可以筛选许多植物幼苗，尽管必须采取一些预防措施以防止在电镀和生长过程中污染植物培养基板。因此，用手术胶带密封拟南芥板至关重要。该实验的另一个优点是，与先前发表的工作相比，它具有更短的12小时光呼吸应激期8。治疗时间的减少是为了更好地区分WT和选定突变体之间的Fv/Fm差异。治疗时间可能需要…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由路易斯安那州董事会（AWD-AM210544）资助。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
