Avaliação da Eficiência Fotossintética em Mutantes Fotorrespiratórios por Análise de Fluorescência de Clorofila
Summary
Descrevemos uma abordagem para medir mudanças na eficiência fotossintética em plantas após tratamento com baixo CO2 usando fluorescência de clorofila.
Abstract
A fotossíntese e a fotorrespiração representam os maiores fluxos de carbono no metabolismo primário das plantas e são necessárias para a sobrevivência das plantas. Muitas das enzimas e genes importantes para a fotossíntese e fotorrespiração têm sido bem estudados há décadas, mas alguns aspectos dessas vias bioquímicas e sua conversa cruzada com vários processos subcelulares ainda não são totalmente compreendidos. Grande parte do trabalho que identificou os genes e proteínas importantes no metabolismo das plantas foi conduzido em ambientes altamente controlados que podem não representar melhor como a fotossíntese e a fotorrespiração funcionam em ambientes naturais e agrícolas. Considerando que o estresse abiótico resulta em eficiência fotossintética prejudicada, o desenvolvimento de uma tela de alto rendimento que possa monitorar tanto o estresse abiótico quanto seu impacto na fotossíntese é necessário.
Portanto, desenvolvemos um método relativamente rápido para rastrear alterações induzidas por estresse abiótico na eficiência fotossintética que podem identificar genes não caracterizados com papéis na fotorrespiração usando análise de fluorescência de clorofila e triagem de baixo CO2 . Este trabalho descreve um método para estudar mudanças na eficiência fotossintética em mutantes knockout transferidos de DNA (T-DNA) em Arabidopsis thaliana. O mesmo método pode ser usado para triagem de mutantes induzidos por metanossulfonato de etila (EMS) ou triagem supressora. A utilização deste método pode identificar candidatos a genes para um estudo mais aprofundado no metabolismo primário das plantas e nas respostas ao estresse abiótico. Os dados deste método podem fornecer informações sobre a função do gene que pode não ser reconhecida até a exposição a ambientes de estresse aumentado.
Introduction
As condições de estresse abiótico comumente vistas nos campos dos agricultores podem afetar negativamente o rendimento das culturas, reduzindo a eficiência fotossintética. Condições ambientais prejudiciais, como ondas de calor, mudanças climáticas, seca e salinidade do solo, podem causar estresses abióticos que alteram a disponibilidade de CO2 e reduzem a resposta de uma planta ao alto estresse leve. Os dois maiores fluxos de carbono terrestres são a fotossíntese e a fotorrespiração, que são essenciais para o crescimento das plantas e o rendimento das culturas. Muitas das importantes proteínas e enzimas envolvidas nesses processos foram caracterizadas em condições de laboratório e identificadas no nível genético1. Embora muito progresso tenha sido feito na compreensão da fotossíntese e da fotorrespiração, muitas etapas, incluindo o transporte entre organelas vegetais, permanecem descaracterizadas 2,3.
A fotorrespiração, o segundo maior fluxo de carbono nas plantas após a fotossíntese, começa quando a enzima Rubisco fixa oxigênio em vez de dióxido de carbono em ribulose 1,5 bisfosfato (RuBP), gerando o composto inibitório 2-fosfoglicolato (2PG)1. Para minimizar os efeitos inibitórios do 2PG e reciclar o carbono previamente fixo, as plantas C3 desenvolveram o processo multiorganelar de fotorrespiração. A fotorrespiração converte duas moléculas de 2PG em uma molécula de 3-fosfoglicerato (3PGA), que pode reentrar no ciclo de fixação de carbono C31. Assim, a fotorrespiração converte apenas 75% do carbono previamente fixado a partir da geração de 2PG e consome ATP no processo. Como resultado, o processo de fotorrespiração é um arrasto significativo de 10% a 50% no processo fotossintético, dependendo da disponibilidade de água e das temperaturas da estação de crescimento4.
As enzimas envolvidas na fotorrespiração têm sido uma área de foco de pesquisa há décadas, mas apenas um pequeno número de proteínas de transporte tem sido caracterizado no nível genético, embora pelo menos 25 etapas de transporte estejam envolvidas no processo 5,6,7. As duas proteínas de transporte que estão diretamente envolvidas no movimento de carbono gerado no processo de fotorrespiração são o glicolato plastídico/transportador de glicerato PLGG1 e o simportador de sódio de ácidos biliares BASS6, ambos envolvidos na exportação de glicolato do cloroplasto 5,6.
Sob ambiente [CO2], Rubisco fixa uma molécula de oxigênio para RuBP aproximadamente 20% do tempo1. Quando as plantas são submetidas a baixas [CO 2], as taxas de fotorrespiração aumentam, tornando a baixa [CO2] um ambiente ideal para testar mutantes que podem ser importantes sob estresse fotorrespiratório elevado. O teste de linhas adicionais de proteína T-DNA de transporte de cloroplasto sob baixo CO2 por 24 h e a medição de alterações na fluorescência de clorofila levaram à identificação de linhas de plantas de bass6-1 que demonstraram um fenótipo mutante de fotorrespiração5. Caracterizações posteriores demonstraram que o BASS6 é um transportador de glicolato na membrana interna do cloroplasto.
Este artigo descreve em detalhes um protocolo semelhante ao que foi inicialmente usado para identificar o BASS6 como um transportador de fotorrespiração, que veio de uma lista de supostas proteínas de transporte localizadas dentro da membrana do cloroplasto8 Este protocolo pode ser usado em um experimento de alto rendimento caracterizando mutantes de T-DNA da Arabidopsis ou plantas mutantes geradas por EMS como uma maneira de identificar genes importantes para manter a eficiência fotossintética sob uma variedade de estresses abióticos, como calor, estresse de alta luminosidade, seca e disponibilidade de CO2 . A triagem de mutantes vegetais usando fluorescência de clorofila tem sido usada no passado para identificar rapidamente genes importantes para o metabolismo primário9. Com até 30% do genoma da Arabidopsis contendo genes que codificam proteínas de função desconhecida ou mal caracterizada, a análise induzida pelo estresse da eficiência fotossintética poderia fornecer informações sobre funções moleculares não observadas em condições controladas em plantas mutantes10. O objetivo deste método é identificar mutantes da via fotorrespiratória usando uma triagem de baixo CO2 . Apresentamos um método para identificar mutantes que interrompem a fotorrespiração após a exposição ao baixo CO2. Uma vantagem deste método é que é uma triagem de alto rendimento para mudas que pode ser feita em um período relativamente curto de tempo. As seções do protocolo de vídeo fornecem detalhes sobre a preparação e esterilização de sementes, crescimento de plantas e tratamento com baixo teor de CO2 , a configuração do sistema de imagem de fluorescência, a medição do rendimento quântico das amostras tratadas, resultados representativos e conclusões.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos experimentais descritos neste artigo vêm com algumas vantagens e limitações. Uma vantagem é que este método pode filtrar muitas mudas de plantas, embora algumas precauções devam ser tomadas para evitar a contaminação da placa do meio da planta durante o processo de chapeamento e crescimento. Portanto, é fundamental selar as placas de Arabidopsis com fita cirúrgica. Outra vantagem deste experimento é que ele tem um período de estresse fotorrespiratório mais curto de 12 h em comparação com o tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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