Evaluación de la eficiencia fotosintética en mutantes fotorrespiratorios mediante análisis de fluorescencia de clorofila
Summary
Describimos un enfoque para medir los cambios en la eficiencia fotosintética en plantas después del tratamiento con bajoCO2 utilizando fluorescencia de clorofila.
Abstract
La fotosíntesis y la fotorrespiración representan los mayores flujos de carbono en el metabolismo primario de las plantas y son necesarios para la supervivencia de las plantas. Muchas de las enzimas y genes importantes para la fotosíntesis y la fotorrespiración han sido bien estudiados durante décadas, pero algunos aspectos de estas vías bioquímicas y su diafonía con varios procesos subcelulares aún no se comprenden completamente. Gran parte del trabajo que ha identificado los genes y proteínas importantes en el metabolismo de las plantas se ha llevado a cabo en entornos altamente controlados que pueden no representar mejor cómo funcionan la fotosíntesis y la fotorrespiración en entornos naturales y agrícolas. Teniendo en cuenta que el estrés abiótico resulta en una eficiencia fotosintética deteriorada, es necesario el desarrollo de una pantalla de alto rendimiento que pueda monitorear tanto el estrés abiótico como su impacto en la fotosíntesis.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método relativamente rápido para detectar cambios inducidos por el estrés abiótico en la eficiencia fotosintética que puede identificar genes no caracterizados con roles en la fotorrespiración utilizando el análisis de fluorescencia de clorofila y la detección de bajoCO2 . Este artículo describe un método para estudiar los cambios en la eficiencia fotosintética en mutantes knockout de ADN transferido (ADN-T) en Arabidopsis thaliana. El mismo método se puede utilizar para la detección de mutantes inducidos por metanosulfonato de etilo (EMS) o la detección de supresores. La utilización de este método puede identificar candidatos a genes para un estudio adicional en el metabolismo primario de las plantas y las respuestas al estrés abiótico. Los datos de este método pueden proporcionar información sobre la función de los genes que puede no reconocerse hasta la exposición a entornos de mayor estrés.
Introduction
Las condiciones de estrés abiótico comúnmente observadas en los campos de los agricultores pueden afectar negativamente los rendimientos de los cultivos al reducir la eficiencia fotosintética. Las condiciones ambientales perjudiciales, como las olas de calor, el cambio climático, la sequía y la salinidad del suelo, pueden causar estrés abiótico que altera la disponibilidad deCO2 y reduce la respuesta de una planta al alto estrés lumínico. Los dos flujos de carbono terrestres más grandes son la fotosíntesis y la fotorrespiración, que son esenciales para el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos. Muchas de las proteínas y enzimas importantes involucradas en estos procesos han sido caracterizadas en condiciones de laboratorio e identificadas a nivel genético1. Aunque se ha avanzado mucho en la comprensión de la fotosíntesis y la fotorrespiración, muchos pasos, incluido el transporte entre orgánulos vegetales, permanecen sin caracterizar 2,3.
La fotorrespiración, el segundo mayor flujo de carbono en las plantas después de la fotosíntesis, comienza cuando la enzima Rubisco fija oxígeno en lugar de dióxido de carbono a ribulosa 1,5 bisfosfato (RuBP), generando el compuesto inhibidor 2-fosfoglicolato (2PG)1. Para minimizar los efectos inhibitorios de 2PG y reciclar el carbono previamente fijado, las plantas C3 han desarrollado el proceso multiorgánulo de fotorrespiración. La fotorrespiración convierte dos moléculas de 2PG en una molécula de 3-fosfoglicerato (3PGA), que puede volver a entrar enel ciclo 1 de fijación de carbono C3. Por lo tanto, la fotorrespiración solo convierte el 75% del carbono previamente fijado de la generación de 2PG y consume ATP en el proceso. Como resultado, el proceso de fotorrespiración es un arrastre significativo del 10% -50% en el proceso fotosintético, dependiendo de la disponibilidad de agua y las temperaturas de la temporada de crecimiento4.
Las enzimas involucradas en la fotorrespiración han sido un área de investigación enfocada durante décadas, pero sólo un pequeño número de proteínas de transporte han sido caracterizadas a nivel genético, a pesar de que al menos 25 pasos de transporte están involucrados en el proceso 5,6,7. Las dos proteínas de transporte que están directamente involucradas en el movimiento del carbono generado en el proceso de fotorrespiración son el transportador de glicolato plastídico/glicerato PLGG1 y el simportador de sodio de ácidos biliares BASS6, ambos involucrados en la exportación de glicolato del cloroplasto 5,6.
Bajo ambiente [CO2], Rubisco fija una molécula de oxígeno a RuBP aproximadamente el 20% del tiempo1. Cuando las plantas se someten a [CO2] bajo, las tasas de fotorrespiración aumentan, lo que hace que el bajo [CO2] sea un entorno ideal para detectar mutantes que pueden ser importantes bajo un estrés elevado de fotorrespiración. La prueba adicional de líneas de proteína de transporte de cloroplastos T-DNA bajo bajo bajoCO2 durante 24 h y la medición de los cambios en la fluorescencia de clorofila llevaron a la identificación de líneas vegetales bass6-1 que demostraron un fenotipo5 mutante de fotorrespiración. La caracterización adicional demostró que BASS6 es un transportador de glicolato en la membrana interna del cloroplasto.
Este artículo describe en detalle un protocolo similar al que se utilizó inicialmente para identificar BASS6 como un transportador de fotorrespiración, que provenía de una lista de proteínas de transporte putativas ubicadas dentro de la membrana del cloroplasto8 Este protocolo se puede utilizar en un experimento de alto rendimiento que caracterice mutantes de ADN-T de Arabidopsis o plantas mutantes generadas por EMS como una forma de identificar genes importantes para mantener la eficiencia fotosintética bajo una gama de tensiones abióticas como el calor, alto estrés lumínico, sequía y disponibilidad deCO2 . El cribado de mutantes vegetales utilizando fluorescencia de clorofila se ha utilizado en el pasado para identificar rápidamente genes importantes para el metabolismo primario9. Con hasta un 30% del genoma de Arabidopsis que contiene genes que codifican proteínas de función desconocida o mal caracterizada, el análisis inducido por el estrés de la eficiencia fotosintética podría proporcionar información sobre las funciones moleculares no observadas en condiciones controladas en plantas mutantes10. El objetivo de este método es identificar mutantes de la vía fotorrespiratoria mediante un cribado bajo deCO2 . Presentamos un método para identificar mutantes que interrumpen la fotorrespiración después de la exposición a niveles bajos deCO2. Una ventaja de este método es que es un cribado de alto rendimiento para plántulas que se puede realizar en un período de tiempo relativamente corto. Las secciones del protocolo de video proporcionan detalles sobre la preparación y esterilización de semillas, el crecimiento de las plantas y el tratamiento con bajo contenido deCO2 , la configuración del sistema de imágenes de fluorescencia, la medición del rendimiento cuántico de las muestras tratadas, resultados representativos y conclusiones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos experimentales descritos en este documento vienen con algunas ventajas y limitaciones. Una ventaja es que este método puede examinar muchas plántulas de plantas, aunque se deben tomar algunas precauciones para evitar la contaminación de la placa de medios vegetales durante el proceso de recubrimiento y crecimiento. Por lo tanto, es fundamental sellar las placas de Arabidopsis con cinta quirúrgica. Otra ventaja de este experimento es que tiene un período de estrés fotorrespiratorio más corto de 12 h en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por la Junta de Regentes de Louisiana (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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