क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा फोटोरेस्पिरेटरी म्यूटेंट में प्रकाश संश्लेषक दक्षता का मूल्यांकन
Summary
हम क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस का उपयोग करके कम सीओ2 के साथ उपचार के बाद पौधों में प्रकाश संश्लेषक दक्षता में परिवर्तन को मापने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।
Abstract
प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन पौधे के प्राथमिक चयापचय में सबसे बड़े कार्बन फ्लक्स का प्रतिनिधित्व करते हैं और पौधे के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन के लिए महत्वपूर्ण कई एंजाइमों और जीनों का दशकों से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, लेकिन इन जैव रासायनिक मार्गों के कुछ पहलुओं और कई उपकोशिकीय प्रक्रियाओं के साथ उनके क्रॉसस्टॉक को अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। पौधे के चयापचय में महत्वपूर्ण जीन और प्रोटीन की पहचान करने वाले अधिकांश काम अत्यधिक नियंत्रित वातावरण के तहत आयोजित किए गए हैं जो प्राकृतिक और कृषि वातावरण के तहत प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन कार्य कैसे करते हैं, इसका सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। यह देखते हुए कि अजैविक तनाव के परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ प्रकाश संश्लेषक दक्षता होती है, एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन का विकास जो अजैविक तनाव और प्रकाश संश्लेषण पर इसके प्रभाव दोनों की निगरानी कर सकता है, आवश्यक है।
इसलिए, हमने प्रकाश संश्लेषक दक्षता में अजैविक तनाव-प्रेरित परिवर्तनों की जांच करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेज़ विधि विकसित की है जो क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस विश्लेषण और कम सीओ 2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेशन में भूमिकाओं के साथ अज्ञात जीनकी पहचान कर सकती है। यह पेपर एराबिडोप्सिस थैलियाना में स्थानांतरित डीएनए (टी-डीएनए) नॉकआउट म्यूटेंट में प्रकाश संश्लेषक दक्षता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसी विधि का उपयोग एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) -प्रेरित उत्परिवर्ती या शमन स्क्रीनिंग की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का उपयोग करने से पौधे के प्राथमिक चयापचय और अजैविक तनाव प्रतिक्रियाओं में आगे के अध्ययन के लिए जीन उम्मीदवारों की पहचान की जा सकती है। इस पद्धति से डेटा जीन फ़ंक्शन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जिसे बढ़े हुए तनाव वातावरण के संपर्क में आने तक पहचाना नहीं जा सकता है।
Introduction
आमतौर पर किसान के खेतों में देखी जाने वाली अजैविक तनाव की स्थिति प्रकाश संश्लेषक दक्षता को कम करके फसल की पैदावार को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। हानिकारक पर्यावरणीय परिस्थितियां जैसे गर्मी की लहरें, जलवायु परिवर्तन, सूखा और मिट्टी की लवणता अजैविक तनाव पैदा कर सकती है जो सीओ2 उपलब्धता को बदल देती है और उच्च प्रकाश तनाव के लिए पौधे की प्रतिक्रिया को कम करती है। दो सबसे बड़े स्थलीय कार्बन फ्लक्स प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन हैं, जो पौधे के विकास और फसल की पैदावार के लिए आवश्यक हैं। इन प्रक्रियाओं में शामिल कई महत्वपूर्ण प्रोटीन और एंजाइमों को प्रयोगशाला स्थितियों के तहत विशेषता दी गई है और आनुवंशिक स्तर 1 पर पहचाना गयाहै। यद्यपि प्रकाश संश्लेषण और फोटोरेस्पिरेशन को समझने में बहुत प्रगति हुई है, पौधों के ऑर्गेनेल के बीच परिवहन सहित कई कदम अज्ञात हैं।
प्रकाश संश्लेषण के बाद पौधों में दूसरा सबसे बड़ा कार्बन प्रवाह, फोटोरेस्पिरेशन तब शुरू होता है जब एंजाइम रूबिस्को कार्बन डाइऑक्साइड के बजाय ऑक्सीजन को रिबुलोज 1,5 बिस्फोस्फेट (आरयूबीपी) में ठीक करता है, जिससे निरोधात्मक यौगिक 2-फॉस्फोग्लाइकोलेट (2पीजी)1 उत्पन्न होता है। 2पीजी के निरोधात्मक प्रभावों को कम करने और पहले से तय कार्बन को रीसायकल करने के लिए, सी 3 पौधों ने फोटोरेस्पिरेशन की बहु-ऑर्गेनेलर प्रक्रिया विकसित की है। फोटोरेस्पिरेशन 2पीजी के दो अणुओं को 3-फॉस्फोग्लिसरेट (3पीजीए) के एक अणु में परिवर्तित करता है, जो सी 3 कार्बन निर्धारण चक्र1 में फिर से प्रवेश कर सकता है। इस प्रकार, फोटोरेस्पिरेशन केवल 2पीजी की पीढ़ी से पहले से तय कार्बन के 75% को परिवर्तित करता है और इस प्रक्रिया में एटीपी का उपभोग करता है। नतीजतन, फोटोरेस्पिरेशन की प्रक्रिया पानी की उपलब्धता और बढ़तेमौसम के तापमान के आधार पर प्रकाश संश्लेषक प्रक्रिया पर एक महत्वपूर्ण 10% -50% ड्रैग है।
फोटोरेस्पिरेशन में शामिल एंजाइम दशकों से अनुसंधान फोकस का एक क्षेत्र रहे हैं, लेकिन आनुवंशिक स्तर पर केवल थोड़ी संख्या में परिवहन प्रोटीन की विशेषता है, भले ही प्रक्रिया 5,6,7 में कम से कम25 परिवहन चरण शामिल हों। दो परिवहन प्रोटीन जो सीधे फोटोरेस्पिरेशन प्रक्रिया में उत्पन्न कार्बन के आंदोलन में शामिल होते हैं, वे प्लास्टिडिक ग्लाइकोलेट / ग्लाइसरेट ट्रांसपोर्टर पीएलजीजी 1 और पित्त एसिड सोडियम सिम्पोरेटर बीएएसएस 6 हैं, जो दोनों क्लोरोप्लास्ट 5,6 से ग्लाइकोलेट के निर्यात में शामिल हैं।
परिवेश [सीओ2] के तहत, रूबिस्को एक ऑक्सीजन अणु को आरयूबीपी में लगभग 20% समय 1 में ठीक करताहै। जब पौधों को कम [सीओ2] के अधीन किया जाता है, तो फोटोरेस्पिरेशन की दर बढ़ जाती है, जिससे कम [सीओ2] उत्परिवर्ती के लिए परीक्षण करने के लिए एक आदर्श वातावरण बन जाता है जो ऊंचा फोटोरेस्पिरेशन तनाव के तहत महत्वपूर्ण हो सकता है। 24 घंटे के लिए कम सीओ 2 के तहत अतिरिक्त कथित क्लोरोप्लास्ट परिवहन प्रोटीन टी-डीएनए लाइनों का परीक्षण और क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस में परिवर्तन को मापने से बास 6-1 पौधे लाइनों की पहचान हुई जो एक फोटोरेस्पिरेशन उत्परिवर्ती फेनोटाइप5 का प्रदर्शन करते थे। आगे के लक्षण वर्णन से पता चला है कि बीएएसएस 6 क्लोरोप्लास्ट की आंतरिक झिल्ली में एक ग्लाइकोलेट ट्रांसपोर्टर है।
यह पेपर एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है जो शुरू में बीएएसएस 6 को फोटोरेस्पिरेशन ट्रांसपोर्टर के रूप में पहचानने के लिए उपयोग किया गया था, जो क्लोरोप्लास्ट झिल्ली के भीतर स्थित कथित परिवहन प्रोटीन की एक सूची से आया था8 इस प्रोटोकॉल का उपयोग एराबिडोप्सिस टी-डीएनए उत्परिवर्ती या ईएमएस-जनित उत्परिवर्ती पौधों की विशेषता वाले उच्च-थ्रूपुट प्रयोग में किया जा सकता है, जो गर्मी जैसे अजैविक तनावों की एक श्रृंखला के तहत प्रकाश संश्लेषक दक्षता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान करने का एक तरीका है। उच्च प्रकाश तनाव, सूखा, और सीओ2 उपलब्धता। क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस का उपयोग करके स्क्रीनिंग प्लांट म्यूटेंट का उपयोग अतीत में प्राथमिक चयापचय के लिए महत्वपूर्ण जीन की तेजी से पहचान करने के लिए किया गयाहै। एराबिडोप्सिस जीनोम के 30% तक जीन होते हैं जो अज्ञात या खराब विशेषता वाले कार्य के प्रोटीन के लिए कोड करते हैं, प्रकाश संश्लेषक दक्षता का तनाव-प्रेरित विश्लेषण उत्परिवर्तीपौधों में नियंत्रित परिस्थितियों में नहीं देखे गए आणविक कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस विधि का लक्ष्य कम सीओ2 स्क्रीनिंग का उपयोग करके फोटोरेस्पिरेटरी मार्ग के उत्परिवर्ती की पहचान करना है। हम उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो कम सीओ2 के संपर्क में आने के बाद फोटोरेस्पिरेशन को बाधित करते हैं। इस विधि का एक लाभ यह है कि यह रोपाई के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग है जिसे अपेक्षाकृत कम समय में किया जा सकता है। वीडियो प्रोटोकॉल अनुभाग बीज तैयार करने और नसबंदी, पौधे की वृद्धि और कम सीओ2 उपचार, प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के विन्यास, उपचारित नमूनों की क्वांटम उपज का माप, प्रतिनिधि परिणाम और निष्कर्ष पर विवरण प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में उल्लिखित प्रयोगात्मक तरीके कुछ फायदे और सीमाओं के साथ आते हैं। एक लाभ यह है कि यह विधि कई पौधों के पौधों को स्क्रीन कर सकती है, हालांकि चढ़ाना और बढ़ती प्रक्रिया के दौरान पौधे मीडिया प्लेट क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को लुइसियाना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स (एडब्ल्यूडी-एएम 210544) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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