Анализ объема территории астроцитов и укладки плитки в толстых свободно плавающих участках тканей
Summary
Этот протокол описывает методы секционирования, окрашивания и визуализации свободно плавающих участков тканей мозга мыши с последующим подробным описанием анализа объема территории астроцитов и перекрытия территории астроцитов или облицовки.
Abstract
Астроциты обладают поразительной степенью морфологической сложности, которая позволяет им взаимодействовать почти с каждым типом клеток и структур в мозге. Благодаря этим взаимодействиям астроциты активно регулируют многие критические функции мозга, включая образование синапсов, нейротрансмиссию и ионный гомеостаз. В мозге грызунов астроциты растут в размерах и сложности в течение первых трех послеродовых недель и создают четкие, не перекрывающиеся территории, чтобы выложить черепицу мозга. Этот протокол обеспечивает установленный метод анализа объема территории астроцитов и облицовки астроцитов с использованием свободно плавающих участков ткани из мозга мыши. Во-первых, этот протокол описывает этапы сбора тканей, криосечения и иммуноокрашения свободно плавающих участков тканей. Во-вторых, этот протокол описывает получение и анализ изображений объема территории астроцитов и объема перекрытия территории с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, в этой рукописи обсуждаются преимущества, важные соображения, общие подводные камни и ограничения этих методов. Этот протокол требует мозговой ткани с разреженной или мозаичной флуоресцентной маркировкой астроцитов и предназначен для использования с общим лабораторным оборудованием, конфокальной микроскопией и коммерчески доступным программным обеспечением для анализа изображений.
Introduction
Астроциты представляют собой тщательно разветвленные клетки, которые выполняют многие важные функции в мозге1. В коре головного мозга мышей радиальные глиальные стволовые клетки дают начало астроцитам во время поздней эмбриональной и ранней постнатальной стадий2. В течение первых трех послеродовых недель астроциты растут в размерах и сложности, развивая тысячи тонких ветвей, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами1. Одновременно астроциты взаимодействуют с соседними астроцитами, чтобы установить дискретные, неперекрывающиеся территории для плитки мозга3, сохраняя при этом связь через каналы щелевого соединения4. Морфология и организация астроцитов нарушаются во многих болезненных состояниях после инсульта или травмы5, что указывает на важность этих процессов для правильной работы мозга. Анализ морфологических свойств астроцитов во время нормального развития, старения и заболевания может дать ценную информацию о биологии и физиологии астроцитов. Кроме того, анализ морфологии астроцитов после генетических манипуляций является ценным инструментом для распознавания клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют установлением и поддержанием морфологической сложности астроцитов.
Анализ морфологии астроцитов в мозге мыши осложняется как сложностью ветвления астроцитов, так и астроцитарной плиткой. Окрашивание антител с использованием промежуточной нити глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в качестве астроцит-специфического маркера захватывает только основные ветви и значительно недооценивает морфологическую сложность астроцитов1. Другие клеточные маркеры, такие как транспортер глутамата 1 (GLT-1; slc1a2), глютаминсинтетаза или S100β, лучше маркируют ветви астроцитов6, но создают новую проблему. Астроцитарные территории в значительной степени не перекрываются, но небольшая степень перекрытия существует на периферических краях. Из-за сложности ветвления, когда соседние астроциты помечены одним цветом, невозможно различить, где заканчивается один астроцит и начинается другой. Разреженная или мозаичная маркировка астроцитов эндогенными флуоресцентными белками решает обе проблемы: флуоресцентный маркер заполняет клетку, чтобы захватить все ветви и позволяет визуализировать отдельные астроциты, которые можно отличить от их соседей. Несколько различных стратегий были использованы для достижения разреженной флуоресцентной маркировки астроцитов с генетическими манипуляциями или без них, включая вирусную инъекцию, плазмидную электропорацию или трансгенные линии мыши. Подробная информация о выполнении этих стратегий описана в ранее опубликованных исследованиях и протоколах 1,7,8,9,10,11,12,13.
В данной статье описан метод измерения объема территории астроцитов из мозга мыши с флуоресцентной маркировкой в разреженной популяции астроцитов (рисунок 1). Поскольку средний диаметр астроцита в коре головного мозга мыши составляет примерно 60 мкм, для повышения эффективности захвата отдельных астроцитов в их совокупности используются участки толщиной 100 мкм. Иммуноокрашивание не требуется, но рекомендуется для усиления эндогенного флуоресцентного сигнала для конфокальной визуализации и анализа. Иммуноокрашивание может также позволить лучше обнаруживать тонкие ветви астроцитов и уменьшать фотоотбеливание эндогенных белков во время получения изображения. Для улучшения проникновения антител в толстые срезы и для сохранения объема ткани от разрезания с помощью визуализации используются свободно плавающие участки тканей. Анализ объема территории астроцитов выполняется с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Дополнительно в этом протоколе описан метод анализа астроцитарной плитки в участках тканей с мозаичной маркировкой, где соседние астроциты экспрессируют различные флуоресцентные метки. Этот протокол был успешно использован в нескольких недавних исследованиях 1,8,9 для характеристики роста астроцитов во время нормального развития мозга, а также влияния генетических манипуляций на развитие астроцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает установленный метод анализа объема территории астроцитов и мозаики астроцитов в коре мыши, подробно описывая все основные этапы, начиная с перфузии и заканчивая анализом изображений. Этот протокол требует мозга от мышей, которые экспрессируют флуоресцентные б…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Микроскопия была выполнена в UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), частично поддержанной финансированием гранта NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 и гранта NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Изображения и данные на рисунке 4 перепечатываются из предыдущей публикации9 с разрешения издателя.
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
