Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties
Summary
Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.
Abstract
Astrocyten bezitten een verbazingwekkende mate van morfologische complexiteit die hen in staat stelt om te interageren met bijna elk type cel en structuur in de hersenen. Door deze interacties reguleren astrocyten actief veel kritieke hersenfuncties, waaronder synapsvorming, neurotransmissie en ionhomeostase. In de hersenen van knaagdieren groeien astrocyten in grootte en complexiteit tijdens de eerste drie postnatale weken en vestigen ze verschillende, niet-overlappende gebieden om de hersenen te betegelen. Dit protocol biedt een gevestigde methode voor het analyseren van astrocytengebiedvolume en astrocytentetettegels met behulp van vrij zwevende weefselsecties uit het muizenbrein. Ten eerste beschrijft dit protocol de stappen voor weefselverzameling, cryosectie en immunostaining van vrij zwevende weefselsecties. Ten tweede beschrijft dit protocol beeldacquisitie en analyse van astrocytengebiedvolume en territoriumoverlappingsvolume, met behulp van commercieel beschikbare beeldanalysesoftware. Ten slotte bespreekt dit manuscript de voordelen, belangrijke overwegingen, veelvoorkomende valkuilen en beperkingen van deze methoden. Dit protocol vereist hersenweefsel met schaarse of mozaïek fluorescerende labeling van astrocyten en is ontworpen om te worden gebruikt met gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, confocale microscopie en in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware.
Introduction
Astrocyten zijn uitgebreid vertakte cellen die veel belangrijke functies in de hersenen vervullen1. In de cortex van de muis geven radiale gliastamcellen aanleiding tot astrocyten tijdens de late embryonale en vroege postnatale stadia2. Tijdens de eerste drie postnatale weken groeien astrocyten in omvang en complexiteit en ontwikkelen ze duizenden fijne takken die rechtstreeks interageren met synapsen1. Tegelijkertijd interageren astrocyten met naburige astrocyten om discrete, niet-overlappende gebieden vast te stellen om de hersenen te betegelen3, terwijl de communicatie via gap junction kanalen4 behouden blijft. Astrocytenmorfologie en organisatie zijn verstoord in veel ziektetoestanden na belediging of verwonding5, wat het belang van deze processen voor een goede hersenfunctie aangeeft. Analyse van de morfologische eigenschappen van astrocyten tijdens normale ontwikkeling, veroudering en ziekte kan waardevolle inzichten bieden in de biologie en fysiologie van astrocyten. Bovendien is de analyse van de morfologie van astrocyten na genetische manipulatie een waardevol hulpmiddel voor het onderscheiden van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de oprichting en het onderhoud van de morfologische complexiteit van astrocyten regelen.
Analyse van astrocytenmorfologie in het muizenbrein wordt bemoeilijkt door zowel astrocytenvertakkingscomplexiteit als astrocytentetegels. Antilichaamkleuring met behulp van het intermediaire filament gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) als een astrocytenspecifieke marker vangt alleen de belangrijkste takken en onderschat de morfologische complexiteit van astrocyten enorm1. Andere celspecifieke markers zoals glutamaattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminesynthetase of S100β doen beter werk bij het labelen van astrocytentakken6, maar introduceren een nieuw probleem. Astrocytengebieden zijn grotendeels niet-overlappend, maar er bestaat een kleine mate van overlap aan de perifere randen. Vanwege de complexiteit van vertakkingen, wanneer naburige astrocyten dezelfde kleur krijgen, is het onmogelijk om te onderscheiden waar de ene astrocyt eindigt en de andere begint. Schaarse of mozaïeketikettering van astrocyten met endogene fluorescerende eiwitten lost beide problemen op: de fluorescerende marker vult de cel om alle takken te vangen en maakt beeldvorming van individuele astrocyten mogelijk die kunnen worden onderscheiden van hun buren. Verschillende strategieën zijn gebruikt om schaarse fluorescerende etikettering van astrocyten te bereiken, met of zonder genetische manipulatie, waaronder virale injectie, plasmidelektroporatie of transgene muislijnen. Details over de uitvoering van deze strategieën worden beschreven in eerder gepubliceerde studies en protocollen 1,7,8,9,10,11,12,13.
Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van het astrocytengebiedvolume van muizenhersenen met fluorescerende labeling in een schaarse populatie astrocyten (figuur 1). Omdat de gemiddelde diameter van een astrocyt in de cortex van de muis ongeveer 60 μm is, worden 100 μm dikke secties gebruikt om de efficiëntie bij het vastleggen van individuele astrocyten in hun geheel te verbeteren. Immunostaining is niet vereist, maar wordt aanbevolen om het endogene fluorescerende signaal voor confocale beeldvorming en analyse te verbeteren. Immunostaining kan ook een betere detectie van fijne astrocytentakken mogelijk maken en fotobleaching van endogene eiwitten tijdens beeldacquisitie verminderen. Om de penetratie van antilichamen in de dikke secties te verbeteren en om het weefselvolume te beschermen tegen secties door beeldvorming, worden vrij zwevende weefselsecties gebruikt. Analyse van het astrocytengebiedvolume wordt uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare beeldanalysesoftware. Bovendien beschrijft dit protocol een methode voor analyse van astrocytentegels in weefselsecties met mozaïeketikettering, waarbij naburige astrocyten verschillende fluorescerende labels uitdrukken. Dit protocol is met succes gebruikt in verschillende recente studies 1,8,9 om astrocytengroei tijdens normale hersenontwikkeling te karakteriseren, evenals de impact van genetische manipulatie op de ontwikkeling van astrocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een gevestigde methode voor het analyseren van het astrocytengebiedvolume en astrocytentegels in de cortex van de muis, waarbij alle belangrijke stappen worden beschreven, beginnend met perfusie en eindigend met beeldanalyse. Dit protocol vereist hersenen van muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in een schaarse of mozaïekpopulatie van astrocyten. Buiten deze vereiste kunnen muizen van elke leeftijd voor dit protocol worden gebruikt, met slechts kleine aanpassingen aan de perfu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microscopie werd uitgevoerd in de UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), gedeeltelijk ondersteund door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. De afbeeldingen en gegevens in figuur 4 zijn met toestemming van de uitgever overgenomen uit een eerdere publicatie9 .
Materials
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympous | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mouting medium | 20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nailpolish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
| Buffers and Solutions | |||
| 10x TBS | xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4 | ||
| 1x TBS | |||
| 1x TBS + Heparin | add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS | ||
| 4% PFA | |||
| 30% Sucrose in TBS | |||
| Freezing Medium | |||
| Sectioning medium | |||
| TBST | 0.2% Triton in 1x TBS | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in 1x TBST | ||
| Mouting medium |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O’Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
