Analyse av astrocyttområdevolum og flislegging i tykke friflytende vevsseksjoner

Summary

Denne protokollen beskriver metoder for seksjonering, farging og avbildning av frittflytende vevsseksjoner av musehjernen, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av analysen av astrocyttområdevolum og astrocyttområdeoverlapping eller flislegging.

Abstract

Astrocytter har en forbløffende grad av morfologisk kompleksitet som gjør dem i stand til å samhandle med nesten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gjennom disse interaksjonene regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunksjoner, inkludert synapsedannelse, nevrotransmisjon og ion homeostase. I gnagerhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løpet av de tre første postnatale ukene og etablerer distinkte, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen. Denne protokollen gir en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser ved hjelp av frittflytende vevsseksjoner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokollen trinnene for vevsinnsamling, kryooseksjon og immunstaining av frittflytende vevsseksjoner. For det andre beskriver denne protokollen bildeanskaffelse og analyse av astrocyttområdevolum og territoriumoverlappingsvolum, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare for bildeanalyse. Til slutt diskuterer dette manuskriptet fordelene, viktige hensyn, vanlige fallgruver og begrensninger ved disse metodene. Denne protokollen krever hjernevev med sparsom eller mosaikk fluorescerende merking av astrocytter, og er designet for å brukes med vanlig laboratorieutstyr, konfiskert mikroskopi og kommersielt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare.

Introduction

Astrocytter er forseggjort forgrenede celler som utfører mange viktige funksjoner i hjernen¹. I musebarken gir radiale glial stamceller opphav til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadiene². I løpet av de tre første postnatale ukene vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet, og utvikler tusenvis av fine grener som direkte samhandler med synapser¹. Samtidig samhandler astrocytter med nærliggende astrocytter for å etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen³, samtidig som kommunikasjonen opprettholdes via gapkrysskanaler⁴. Astrocyttmorfologi og organisasjon blir forstyrret i mange sykdomstilstander etter fornærmelse eller skade⁵, noe som indikerer viktigheten av disse prosessene for riktig hjernefunksjon. Analyse av astrocyttmorfologiske egenskaper under normal utvikling, aldring og sykdom kan gi verdifull innsikt i astrocyttbiologi og fysiologi. Videre er analyse av astrocyttmorfologi etter genetisk manipulasjon et verdifullt verktøy for å skjelne de cellulære og molekylære mekanismene som styrer etableringen og vedlikeholdet av astrocyttmorfologisk kompleksitet.

Analyse av astrocyttmorfologi i musehjernen er komplisert av både astrocyttforgrening av kompleksitet og astrocyttfliser. Antistofffarging ved hjelp av mellomliggende filament glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astrocyttspesifikk markør fanger bare de store grenene, og undervurderer i stor grad astrocyttmorfologiske kompleksitet¹. Andre cellespesifikke markører som glutamattransportør 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminsyntetase eller S100β gjør en bedre jobb med å merke astrocyttgrener⁶, men introdusere et nytt problem. Astrocyttområder er stort sett ikke-overlappende, men det finnes en liten grad av overlapping ved de perifere kantene. På grunn av kompleksiteten i forgrening, når nærliggende astrocytter er merket med samme farge, er det umulig å skille hvor den ene astrocytten slutter og den andre begynner. Sparsom eller mosaikkmerking av astrocytter med endogene fluorescerende proteiner løser begge problemene: Fluorescerende markør fyller cellen for å fange alle grenene og tillater avbildning av individuelle astrocytter som kan skille seg fra sine naboer. Flere forskjellige strategier har blitt brukt for å oppnå sparsom fluorescerende merking av astrocytter, med eller uten genetisk manipulasjon, inkludert viral injeksjon, plasmid elektroporasjon eller transgene muselinjer. Detaljer om gjennomføringen av disse strategiene er beskrevet i tidligere publiserte studier og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.

Denne artikkelen beskriver en metode for måling av astrocyttområdevolum fra musehjerner med fluorescerende merking i en sparsom populasjon av astrocytter (figur 1). Fordi den gjennomsnittlige diameteren på en astrocytt i musebarken er ca. 60 μm, brukes 100 μm tykke seksjoner for å forbedre effektiviteten i å fange individuelle astrocytter i sin helhet. Immunostaining er ikke nødvendig, men anbefales å forbedre det endogene fluorescerende signalet for konfomisk avbildning og analyse. Immunstaining kan også muliggjøre bedre påvisning av fine astrocyttgrener og redusere fotobleaching av endogene proteiner under bildeoppkjøp. For å forbedre antistoffinntrengning i de tykke seksjonene, og for å bevare vevsvolumet fra seksjonering gjennom avbildning, brukes frittflytende vevsseksjoner. Analyse av astrocytt territorium volum utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildeanalyse programvare. I tillegg beskriver denne protokollen en metode for analyse av astrocyttfliser i vevsseksjoner med mosaikkmerking, der nærliggende astrocytter uttrykker forskjellige fluorescerende etiketter. Denne protokollen har blitt brukt med hell i flere nyere studier ^1,8,9 for å karakterisere astrocyttvekst under normal hjerneutvikling, samt effekten av genetisk manipulasjon på astrocyttutvikling.

Protocol

Alle mus ble brukt i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina ved Chapel Hill og Division of Comparative Medicine (IACUC-protokollnummer 21-116.0). Mus av begge kjønn på barseldag 21 (P21) ble brukt til disse eksperimentene. CD1-mus ble oppnådd kommersielt (Materialliste), og MADM9 WT:WT- og MADM9 WT:KO-mus ble beskrevet tidligere9. MERK: Denne protokollen krever hjerner med fluorescerende prote…

Representative Results

Figur 1 viser en skjematisk oversikt over hovedtrinnene og arbeidsflyten for denne protokollen. Figur 2 viser skjermbilder av viktige trinn ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren for å generere en overflate, generere flekker nær overflaten og generere et konveks skrog. Figur 3 viser anvendelsen av denne teknikken for å bestemme astrocyttområdeoverlapping/-flislegging. I figur 4 viser representative r…

Discussion

Denne protokollen beskriver en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser i musebarken, som beskriver alle de viktigste trinnene som begynner med perfusjon og slutter med bildeanalyse. Denne protokollen krever hjerner fra mus som uttrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikkpopulasjon av astrocytter. Utenfor dette kravet kan mus i alle aldre brukes til denne protokollen, med bare mindre justeringer av perfusjonsinnstillinger og volumet av frysemedier lagt til innebyggingsfor…

Materials

#5 forceps	Roboz	RS-5045
1 mL TB Syringe	Becton Dickinson (BD)	309623
10x TBS (tris-buffered saline)			30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate	Genesee Scientific	25-106MP
1x TBS			100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin			28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate	Genesee Scientific	25-107MP
30% Sucrose in TBS			15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS			40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin			0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice	Charles River	022
Collection vial for brains	Fisher Scientific	03-337-20
Confocal acquisition software	Olympous	FV31S-SW
Confocal microscope	Olympus	FV3000RS
Coverslips	Fisher Scientific	12544E
Cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX50
Cryostat blade	Thermo Scientific	3052835
DAPI	Invitrogen	D1306
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Freezing Medium			2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody	Aves Labs	GFP1010
Glycerol	Thermo Scientific	158920010
Goat anti-chicken 488	Invitrogen	A-11039
Goat anti-rabbit 594	Invitrogen	A11037
Goat Serum	Gibco	16210064
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Imaris	Bitplane	N/A	Version 9.8.0
MATLAB	MathWorks	N/A
Metal lunch tin	AQUARIUS	N/A	From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol	Sigma-Aldrich	152463
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5921
Mouting medium			20mM Tris pH8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate ; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nailpolish	VWR	100491-940
N-propyl gallate	Sigma-Aldrich	02370-100G
O.C.T.	Fisher Scientific	23-730-571
Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC	Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6"	Roboz	RS-6820
Orbital platform shaker	Fisher Scientific	88861043	Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush	Bogrinuo	N/A	From Amazon, "Detail Paint Brushes – Miniature Brushes"
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Pasteur pipet (5.75")	VWR	14672-608
Pasteur pipet (9")	VWR	14672-380
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9541-500G
Razor blade	Fisher Scientific	12-640
RFP antibody	Rockland	600-401-379
Sectioning medium			1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides	VWR	48311-703
Sodium chrloide	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
TBST (TBS + Triton X-100)			0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet	VWR	414004-002
Tri-bromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Thermo Scientific	424570025
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Triton X-100 (high-quality)	Fisher Scientific	50-489-120
XTSpotsConvexHull	N/A	N/A	custom XTension provide as supplementary material
Buffers and Solutions
10x TBS			xx mM Tris, xx mM NaCl, xx mM KCl, pH 7.4
1x TBS
1x TBS + Heparin			add xx mg Heparin to xx mL of 1x TBS
4% PFA
30% Sucrose in TBS
Freezing Medium
Sectioning medium
TBST			0.2% Triton in 1x TBS
Blocking and antibody buffer			10% goat serum in 1x TBST
Mouting medium