Littekenontwikkeling visualiseren met behulp van SCAD Assay - een ex-situ skin scarring assay
Summary
Dit protocol beschrijft het genereren van een huid-fascia explant genaamd “SCar like tissue in A Dish” of SCAD. Dit model maakt een ongekende visualisatie van enkele fibroblasten mogelijk tijdens littekenvorming.
Abstract
De wereldwijde reactie van zoogdieren op het afdichten van diepe weefselwonden is door littekenvorming en weefselcontractie, gemedieerd door gespecialiseerde fascia fibroblasten. Ondanks de klinische betekenis van littekenvorming en verminderde wondgenezing, is ons begrip van fascia fibroblastdynamica bij wondgenezing vluchtig vanwege het gebrek aan relevante assays die directe visualisatie van fibroblastchoreografie en -dynamiek in complexe omgevingen zoals in huidwonden mogelijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om ex-situ huidlittekens te genereren met behulp van SCAD of “SCar-achtig weefsel in A Dish” dat de complexe omgeving van huidwonden nabootst. In deze test wordt de huid van 2 mm van volledige dikte weggesneden en ondersteboven gekweekt in media gedurende 5 dagen, gedurende welke littekens en huidcontracturen zich uniform ontwikkelen. Deze methodologie, in combinatie met fibroblast-lineage specifieke transgene muismodellen, maakt visualisatie van individuele fibroblastlijnen over het hele wondherstelproces mogelijk. Over het algemeen helpt dit protocol onderzoekers bij het begrijpen van fundamentele processen en mechanismen van wondherstel, waarbij de effecten van modulatoren op wondgenezingsresultaten direct worden onderzocht.
Introduction
Wondgenezing is een proces van herstel van gebroken wonden. Weefselletsels bij ongewervelde dieren resulteren in gedeeltelijke of volledige regeneratie. Daarentegen reageren zoogdieren op diep letsel door littekens, een proces dat is afgestemd op het snel afdichten van wonden met dichte pluggen van matrixvezels die het doorgebroken gebied minimaliseren en tegelijkertijd de gewonde site permanent vervormen 1,2,3. Grote brandwonden op de huid of diepe open wonden bij zoogdieren resulteren in pathologische fenotypen zoals hypertrofische of keloïde littekens 4,5. Deze uitbundige littekens veroorzaken een enorme belasting voor klinische en wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Alleen al in de VS kost littekenbeheer jaarlijks ongeveer $ 10 miljard 6,7. Daarom is de ontwikkeling van relevante methodologieën nodig om de fundementale processen en mechanismen die betrokken zijn bij littekenvorming beter te begrijpen.
In de afgelopen jaren heeft een breed scala aan studies bij muizen heterogene fibroblastpopulaties onthuld met verschillende functionele potenties op basis van hun oorsprong op bepaalde huidlocaties 8,9,10. In de achterhuid identificeerden Rinkevich et al., 2015, dat een specifieke fibroblastpopulatie met een vroege embryonale expressie van Engrailed-1 (En1), epf (engrailed positive fibroblast) genoemd, bijdraagt aan cutane littekens bij verwonding. Omgekeerd draagt een andere fibroblastlijn zonder voorgeschiedenis van ingebakken expressie, Engrailed negative fibroblast (ENF), niet bij aan littekenvorming8. Het in kaart brengen van deze En1-afstammingslijnen met behulp van Cre-gestuurde transgene muislijnen gekruist naar fluorescentie reporter muislijnen zoals R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) maakt visualisatie van EPF- en ENF-populaties mogelijk.
Het bestuderen van fibroblastmigratie in vivo gedurende meerdere dagen wordt beperkt door ethische en technische beperkingen. Bovendien is het technisch een technische uitdaging om samengestelde, virale en neutraliserende antilichaambibliotheekschermen te moduleren om routes te moduleren die betrokken zijn bij littekens. Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen het vermogen om fibroblastmigratie en littekenvorming in echte huidmicro-omgevingen, uniformiteit in littekenontwikkeling en weefselcomplexiteit die in vivo huidomgevingen emuleertte visualiseren 11,12. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een ex vivo littekentest genaamd SCAD (SCar-achtig weefsel in A Dish)13,14. Deze eenvoudige test kan worden uitgevoerd door een huid van 2 mm van volledige dikte met de epidermis, de dermis en de subcutane fasciaregio’s te exciëren en deze gedurende maximaal 5 dagen te kweken in dmso-media met serumsupplement. Littekens gegenereerd door SCAD repliceren op betrouwbare wijze transcriptomische en proteomische kenmerken van in vivo littekens. Bovendien maken SCADs gegenereerd uit relevante transgene muislijnen (bijv. En1-muizen) gekruist met fluorescerende reportermuislijnen de visualisatie van fibroblastmigratiedynamiek en littekenontwikkeling met een ongekende resolutie mogelijk. Bovendien kan dit model eenvoudig worden aangepast voor toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. compound library, antilichaambibliotheek of virale screening)13,14. In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om SCADs en daaropvolgende downstream verwerkingstoepassingen te genereren om cellulaire en matrixdynamiek in littekenontwikkeling te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om littekenvorming na letsel te begrijpen. Hoewel er in dit opzicht veel vooruitgang is geboekt, zijn de werkelijke mechanismen nog steeds niet duidelijk. In tegenstelling tot de vorige techniek bevat het SCAD-model alle celtypen en cutane lagen, waardoor de complexiteit van native skin18,19 behouden blijft. Deze methodologie is in staat om fundamentele datasets te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen alle co-auteurs van Jiang et al. 2020 voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van SCAD-methodologie13. We bedanken Dr. Steffen Dietzel en de Bioimaging-kernfaciliteit aan de Ludwig-Maximilans-Universität voor de toegang tot het Multiphoton-systeem. Y.R. werd ondersteund door de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), de European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) en de LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
