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Biology

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63819
, ,
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies,Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

ここでは、微小管束を in vitroで 再構成し、光学トラップと全反射蛍光顕微鏡を同時に使用して、微小管束に及ぼされる力を直接定量化するためのプロトコルを紹介します。このアッセイは、活性微小管ネットワーク内のタンパク質アンサンブルによって生成される力と変位のナノスケールレベルの測定を可能にします。

Abstract

微小管ネットワークは、小胞輸送のトラックとして機能することから、染色体分配を調節するための有糸分裂中の特殊なアレイとして機能することまで、幅広いタスクを実行するために細胞で使用されます。微小管と相互作用するタンパク質には、キネシンやダイニンなどの能動や方向性運動を発生させるモーターや、フィラメントを高次ネットワークに架橋したり、フィラメントのダイナミクスを調節したりする非モータータンパク質などがあります。これまで、微小管関連タンパク質の生物物理学的研究は、小胞輸送に必要な単一モータータンパク質の役割に圧倒的に焦点を当てており、キネシンやダイニンの力発生特性やメカノケミカル制御の解明は大きく進歩してきました。しかしながら、微小管が有糸分裂紡錘体内でのフィラメントスライド中など、貨物およびトラックの両方として作用するプロセスについては、関与する架橋タンパク質のアンサンブルの生物物理学的調節についてはほとんど理解されていない。ここでは、精製された微小管と有糸分裂タンパク質から再構成された架橋微小管最小ネットワーク内の力の生成と応答を直接調査するための方法論について詳しく説明します。微小管対は目的のタンパク質によって架橋され、1つの微小管は顕微鏡カバーガラスに固定化され、2番目の微小管は光トラップによって操作されます。同時全反射蛍光顕微鏡法により、フィラメントがスライドして力を発生させるときに、この微小管ネットワークのすべてのコンポーネントのマルチチャンネル視覚化が可能になります。また、これらの技術を使用して、キネシン-5アンサンブルによって加えられる押し力と、有糸分裂MAP PRC1によって架橋された滑り微小管ペア間で粘性のあるブレーキ力がどのように発生するかを示します。これらのアッセイは、紡錘体の組み立てと機能のメカニズムに関する洞察を提供し、ニューロンや極性上皮細胞の軸索や樹状突起など、さまざまな状況で高密度の微小管ネットワーク力学を研究するために、より広く適応させることができます。

Introduction

細胞は微小管ネットワークを使用して、小胞輸送1,2,3から有糸分裂中の染色体分配4,5,6に至るまで、さまざまな機械的タスクを実行します。分子モータータンパク質のキネシンやダイニンなど、微小管と相互作用するタンパク質の多くは力を発生させ、機械的負荷によって調節されます。これらの重要な分子がどのように機能するかをよりよく理解するために、研究者は光学トラップやTIRF顕微鏡などの単一分子生物物理学的方法を使用して、個々のタンパク質の無負荷ステッピング速度、処理性、力と速度の関係などの重要なパラメーターを直接監視しています。最も一般的に使用されている実験幾何学は、球状の形状とサイズがモーター駆動の輸送を受けている小胞を模倣するトラッピングビーズにモータータンパク質を直接付着させることでした。キネシン-1 7,8,9、キネシン-2 10,11,12、キネシン-313,14,15,16キネシン-517,18、キネシン-8 19,20、ならびにダイニンおよびダイニン錯体21,22を含む多数のキネシン、23、24、25は、これらの方法で検討されている。

しかし、多くの細胞プロセスでは、モータータンパク質と非モータータンパク質は、トラックとカーゴの両方として微小管を使用します26,27。さらに、微小管フィラメントが高次バンドルに架橋されているこれらのシナリオでは、これらのタンパク質は単一のユニットではなくアンサンブルとして機能します。例えば、分裂した体細胞内で、高密度フィラメントネットワークが自己組織化して有糸分裂紡錘体装置28、29、30を構築する。極間紡錘体微小管ネットワークは非常にダイナミックで、マイナス端が紡錘体極を向いており、プラス端が紡錘体赤道付近で重なり合うように大きく配置されています。紡錘体内のフィラメントは、キネシン-5 31,32,33、キネシン-12 34,35,36、およびキネシン-1437,38,39などのモータータンパク質、またはPRC1 40,41,42,43またはNuMA 44,45などの非モータータンパク質によって架橋されています。46。それらは、極方向のフラックスなどのプロセス中、または中期または後期47,48,49,50,51,52中の染色体分離中の染色体中心を調整している間に、頻繁に移動または機械的ストレスを経験します。したがって、有糸分裂によるミクロンスケールのスピンドル装置の完全性は、相互作用するフィラメントのこのネットワークによって生成および維持される押し力と引っ張り力の慎重に調整されたバランスに依存しています。しかし、この機械的制御を調査し、タンパク質アンサンブルがどのように連携して微小管の動きを調整し、紡錘体を適切に組み立てるのに必要な力を生み出すかを説明するために必要なツールは最近開発されたばかりであり、動的微小管ネットワークを定義する生物物理学的規則を理解し始めたばかりです。

この原稿の目的は、架橋微小管ペアを in vitroで再構成し、微小管と架橋タンパク質の両方の蛍光視覚化とナノスケールの力測定を同時に可能にする顕微鏡チャンバーにこれらのバンドルを固定化し、これらのデータを堅牢に処理するために必要な手順を実証することです。蛍光標識された微小管を安定して重合するために必要な手順、取り付け用の顕微鏡カバーガラスの準備、光学トラップ実験用のポリスチレンビーズの準備、および生体 内機能を維持し ながら直接生物物理学的操作を可能にする架橋フィラメントネットワークの組み立てに必要な手順を詳しく説明します。

Protocol

1.微小管の調製 注:GFP標識架橋タンパク質を使用する場合、微小管の有機フルオロフォア標識は、赤色(ローダミンなど)および遠赤色(ビオチン化HiLyte647など、本文の残りの部分ではビオチン化遠赤色と呼ばれます)が適しています。高品質のクワッドバンド全反射蛍光(TIRF)フィルタを使用することで、イメージング中に3つのチャンネル間のクロストークを最小限…

Representative Results

生物物理学的分析に適した微小管束の調製は、いくつかの重要な基準が満たされれば成功したと見なされます。まず、3色でイメージングすると、オーバーラップ領域を優先的に装飾する架橋タンパク質の濃度を持つ2つの整列した微小管が明らかになります(図5B、C、および図6B)。理想的には、ローダミン微小管のオーバー…

Discussion

微小管ネットワークは、本質的に機械的である幅広いタスクを実行するために、無数の細胞タイプによって採用されています。細胞が健康な状態と病気の状態の両方でどのように機能するかを説明するためには、これらのミクロンスケールのネットワークが、それらを集合的に構築するナノメートルサイズのタンパク質によってどのように組織化および制御されているかを理解することが重?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、R21 AG067436(JPおよびSFへ)、T32 AG057464(ETへ)、およびレンセラー工科大学科学学校スタートアップファンド(SFへ)からの支援に感謝したいと思います。

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915–96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237
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Microtubule BundlesCytoskeletal NetworksForce MeasurementOptical TrapTIRF MicroscopySingle-molecule ExperimentsProtein ConcentrationProtein DensityMitosisNeural DevelopmentMuscle ContractionCell MigrationStreptavidinNeutrAvidinCaseinBiotinylated MicrotubulesRhodamine MicrotubulesRigor Kinesin-coated BeadsReaction Buffer
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Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).
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