Summary
Autoimmun encefalit är en ny kategori av antikroppsmedierade sjukdomar i centrala nervsystemet. Hippocampusneuroner kan användas för att upptäcka och karakterisera dessa antikroppar. Denna artikel tillhandahåller ett protokoll för primär cellodling och immunfärgning för att bestämma autoantikroppar i serum och cerebrospinalvätska hos patienter.
Abstract
Under de senaste 15 åren har en ny kategori av antikroppsmedierade sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) karakteriserats och definieras nu som "autoimmun encefalit" (AE). Det finns för närvarande 17 kända AE-syndrom, och alla är associerade med antikroppar mot neuroncellytan eller synaptiska proteiner. De kliniska syndromen är komplexa och varierar beroende på typen av associerad antikropp. Den mest kända av dessa sjukdomar är anti-N-metyl D-aspartatreceptor (NMDAR) encefalit, som är en framträdande neuropsykiatrisk störning i samband med allvarliga minnes- och beteendestörningar. De associerade antikropparna reagerar med GluN1-underenheten i NMDAR vid den N-terminala domänen. Det tillvägagångssätt som oftast används för upptäckt och karakterisering av AE-antikroppar innefattar kulturen av dissocierade, foster-, gnagar-hippocampusneuroner. Under processen med antikroppskarakterisering utsätts levande neuroner i kulturen för patienternas serum eller CSF, och detekteringen av reaktivitet indikerar att patientens serum- eller CSF-prover innehåller antikroppar mot neuronala ytantigener. Hippocampuskulturer kan också användas för att avgöra om antikropparna hos patienter är potentiellt patogena genom att undersöka om de orsakar strukturella eller funktionella förändringar av neuronerna. Framgångsnivån för dessa studier beror på kulturernas kvalitet och på de protokoll som används för att erhålla och detektera reaktiviteten hos patientprover. Denna artikel ger ett optimerat protokoll för primär cellodling av fosterråtta hippocampusneuroner i kombination med immunfärgning för att bestämma närvaron av antikroppar i serum eller CSF hos patienter. Ett exempel på hur man kan undersöka de potentiella patogena effekterna av NMDAR-antikroppar med hjälp av odlade neuroner och kalciumavbildning presenteras också.
Introduction
Autoimmun encefalit (AE) är en nyligen upptäckt kategori av sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) medierade av antikroppar som riktar sig mot neuronala ytor eller synaptiska proteiner 1,2. De kliniska egenskaperna varierar beroende på antikroppen men inkluderar vanligtvis nedsatt minne och kognition, förändrat beteende och psykiatriska symtom, onormala rörelser, sömndysfunktion, minskad medvetenhetsnivå och anfall. Dessa störningar kan drabba individer i alla åldrar, med vissa typer av AE som främst drabbar barn och unga vuxna2.
Under de senaste 15 åren har 17 AE-syndrom med antikroppar mot specifika neuronala yt-/synaptiska proteiner beskrivits (tabell 1). Några exempel på de neuronala målen inkluderar de synaptiska excitatoriska receptorerna NMDAR3,4 och AMPAR5, den synaptiska hämmande receptorn GABAbR6, det neuronala utsöndrade proteinet LGI17 och celladhesionsmolekylen IgLON58. För de flesta av dessa AE har studier visat att antikropparna stör strukturen eller funktionen hos deras målantigen, vilket starkt stöder en patogen roll. Till exempel, i anti-NMDAR-encefalit, reagerar antikropparna med den N-terminala domänen för GluN1-underenheten i NMDAR, vilket ger en selektiv och reversibel internalisering av dessa receptorer som resulterar i framträdande neuropsykiatriska förändringar 4,9,10,11. Således kan identifieringen av någon av de 17 kända antikropparna i serumet eller CSF hos en patient också användas som ett diagnostiskt test som fastställer diagnosen av en specifik AE.
En av de tekniker som oftare används för identifiering och karakterisering av dessa antikroppar innefattar användning av kulturer av dissocierade, foster-, gnagare hippocampusneuroner. Dessa kulturer är användbara av flera skäl: embryonal hjärna är lätt att dissociera och innehåller en låg nivå av glialceller, den största källan till kontaminering i neuronala kulturer12; cellpopulationen i hippocampus är relativt homogen jämfört med de flesta andra regioner i CNS, med pyramidala celler som representerar den stora majoriteten13,14; kulturer framställs från embryon i sent stadium när genereringen av pyramidala neuroner är fullständig men granulatceller ännu inte har utvecklats, vilket ytterligare ökar kulturens homogenitet; när de odlas uttrycker pyramidala neuroner de flesta av sina huvudsakliga fenotypiska egenskaper, kan bilda välutvecklade dendriter och etablera synaptiskt anslutna nätverk som kan användas för strukturella och elektrofysiologiska undersökningar12,13; Eftersom antikroppar inte kan penetrera levande neuroner möjliggör användningen av levande kulturer identifiering av antigena mål som finns på cellytan; och immunoprecipitering av antikroppsantigenkomplexet från neuronala kulturer möjliggör identifiering av målantigenet5.
Framgången för studier med neuronala kulturer är mycket beroende av kvaliteten på kulturerna och de protokoll som används för att bedöma immunreaktiviteten hos en patients serum eller cerebrospinalvätska (CSF). Variabler som kan påverka kulturerna inkluderar förfarandena för isolering av hippocampus före odlingsutveckling, dissociation av vävnaden, pläteringstätheten, den använda tillväxtytan och mediets sammansättning13,15,16. Denna artikel ger ett optimerat protokoll för primär cellodling av fostrets hippocampusneuroner i kombination med fluorescerande immunfärgning som kan användas för att bestämma närvaron av antikroppar mot kända AE-antigener och potentiellt nya ytmål. Det ger också ett exempel på hur man undersöker de patogena effekterna av NMDAR-antikroppar genom levande cellavbildningstekniker med odlade hippocampusneuroner som uttrycker en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI) från GCaMP-familjen, GCaMP5G.
| Målprotein | Protein funktion | Cell fack | Huvud syndrom |
| NMDAR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Anti-NMDAR encefalit |
| AMPAR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Limbisk encefalit |
| GluK2 | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
| GABAaR | Jon Chanel | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
| GABAbR | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Limbisk encefalit |
| mGluR1 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
| mGluR2 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
| mGluR5 | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Hjärninflammation |
| D2R | Metabotrop receptor | Synaptiskt protein | Basal ganglier encefalit |
| LGI1 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
| CASPR2 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
| IgLON5 | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Anti-IgLON5 sjukdom |
| Neurexin-3α | Vidhäftningsmolekyl | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
| DNER (Tr) | Transmembran protein | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
| SEZ6L | Transmembran protein | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
| Amfifysin | Strukturell molekyl | Protein från cellytan | Limbisk encefalit |
| DPPX | Peptidas | Protein från cellytan | Hjärninflammation |
Tabell 1: Antikroppar mot neuroncellytan och synaptiska proteiner.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av den lokala etiska kommittén vid universitetet i Barcelona efter europeiska (2010/63 / UE) föreskrifter om användning och vård av försöksdjur. Skriftligt informerat samtycke erhölls från patienter och studien godkändes av den lokala institutionella granskningsnämnden för användning av humana prover (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
OBS: Det finns tre delar i det nuvarande protokollet. Den första är för att etablera neuronala kulturer, den andra är för detektering av ytantikroppar med användning av levande kulturer av neuroner, och den tredje är att bestämma patogeniciteten hos dessa antikroppar.
DEL 1: Etablering av dissocierade, foster-, gnagare hippocampusala neuronala kulturer
1. Förberedande steg
- Poly-L-lysinbeläggning av pläteringsytorna (3 dagar före dissektion)
- Bered boratbufferten genom att tillsätta 2,38 g borsyra och 1,27 g borax till 500 ml destillerat vatten under omrörning i 15 minuter tills det är upplöst. Sterilisera buffertlösningen under en huva genom filtrering (0,2 μm porstorlek), etikett och förvaring vid rumstemperatur (RT).
OBS: Denna lösning är stabil och kan användas i 6 månader.
VARNING: Vid beredning av boratbuffert, använd rekommenderad personlig skyddsutrustning. - Bered stamlösningen av poly-L-lysin (PLL) (100 mg/ml) genom att tillsätta 1 g PLL till 10 ml destillerat vatten under omrörning tills det är upplöst. Bered 500 μL alikvoter av PLL-stamlösning. För att uppnå en slutlig koncentration på 1 mg/ml, tillsätt 500 μl PLL-alikvot till 50 ml boratbuffert och virvla tills den är upplöst och sterilisera lösningen genom filtrering (0,2 μm porstorlek).
OBS: Denna lösning är stabil och kan användas i 6 månader. - Förbered ytorna för beläggning. Använd täckglas med en diameter på 12 mm för immunfärgningsprocedurer och glasbottenskålar för studier som inkluderar avbildning av levande neuroner. Om du använder täckglas, autoklav och placera sedan fem täckglas i varje skål (3,5 cm diameter).
OBS: Tjockleken på täckglaset påverkar kvaliteten och intensiteten på signalen för de förvärvade bilderna. De flesta mikroskopmål är utformade för # 1.5 täckglas. Välj lämpliga täckglas enligt bildinställningar och tekniker. - Under en huva, tillsätt 1,5 ml PLL-lösning till varje maträtt (glasbottenfat eller 3,5 cm skål med fem täckblad). Se till att alla täckglas är nedsänkta och förvaras vid RT i 24 timmar.
- 2 dagar före dissektion, aspirera PLL-lösningen och tvätta med sterilt endotoxinfritt vatten, se till att täckglasen är nedsänkta. Håll vatten i diskarna och förvara vid RT i 24 timmar.
- 1 dag före dissektion, aspirera vattnet och ersätt det med NB + B27 odlingsmedia (se nedan) och placera diskarna i en inkubator vid 37 ° C i 24 timmar.
- Bered boratbufferten genom att tillsätta 2,38 g borsyra och 1,27 g borax till 500 ml destillerat vatten under omrörning i 15 minuter tills det är upplöst. Sterilisera buffertlösningen under en huva genom filtrering (0,2 μm porstorlek), etikett och förvaring vid rumstemperatur (RT).
- Beredning av odlingsmedia och stamlösning (1 dag före dissektion)
- Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM): Till 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) utan L-glutamin och fenolrött, tillsätt 50 ml hästserum, 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10 000 U / ml). Filtrera (0,2 μm porstorlek) och förvara alikvoter i 5 ml vid 4 oC med ett tätt tillslutet lock.
OBS: Denna lösning är stabil och kan användas i 1 månad. - Neurobasal (NB) medium kompletterat med B27 (NB + B27): Till 50 ml NB-medium utan fenolrött, tillsätt 1 ml B27-tillskott.
- Hibernate-E medium kompletterat med B27 (Viloläge + B27): Till 50 ml hibernate-E medium, lägg till 1 ml B27 tillägg.
- Extracellulär fysiologisk lösning (EPS): Tillsätt följande till 1 liter sterilt vatten vid de angivna slutkoncentrationerna: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glukos (20 mM) och CaCl2(2 mM). Rör om tills det är upplöst och justera pH-värdet till 7,4 genom att tillsätta NaOH (0,5 M) eller HCl (0,5 M). Sterilisera under huven genom filtrering (0,2 μm porstorlek) och förvara vid 4 oC.
- Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM): Till 500 ml DMEM High Glucose (4,5 g / L) utan L-glutamin och fenolrött, tillsätt 50 ml hästserum, 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 10 ml L-glutamin (200 mM), 10 ml natriumpyruvat (100 mM), 10 ml penicillin-streptomycin (10 000 U / ml). Filtrera (0,2 μm porstorlek) och förvara alikvoter i 5 ml vid 4 oC med ett tätt tillslutet lock.
- Utrustning och annat laboratoriematerial (dissektionsdag)
- Ställ in ett vattenbad på 37 °C. Värm följande alikvoter: 50 ml HBSS och 5 ml DMEM.
- Sterilisera följande verktyg genom att nedsänka i en bägare som innehåller absolut etanol (figur 1B): pincett, böjda pincett, sax, finböjda tångar, fina raka pincett, operationssax, finvinklade pincett och precisionsfjädersax.
OBS: För att skydda verktygen, placera ett mjukt material (t.ex. vetenskapliga precisionsservetter) längst ner på bägaren. - Fyll två brickor med is och placera följande föremål.
- Isbricka 1 (figur 1C): Placera kirurgiska verktyg i bägaren med absolut etanol, en bägare med HBSS för att skölja de kirurgiska verktygen, en 10 cm skål med HBSS för att placera embryona, en 6 cm skål med HBSS för att placera embryonas huvuden och en 6 cm skål med Hibernate + B27 för att placera embryonas hjärnor.
- Isbricka 2: Placera en alikvot på 1 ml trypsin 2,5% och en 3,5 cm skål med Hibernate + B27 för den dissekerade hippocampus.
OBS: Den tid som behövs för denna procedur beror på prövarens erfarenhet och antalet embryon som ska dissekeras. Därför måste isen förbli frusen under den tid som behövs. Polystyrenbrickor rekommenderas för detta ändamål.
2. Dissektion och sådd (figur 1)
- Hippocampus isolering
OBS: Dräktiga råttor med embryon vid E18 avlivas omedelbart innan protokollet startar i enlighet med den lokala etiska kommittén vid universitetet i Barcelona, enligt europeiska (2010/63/UE) föreskrifter om användning och vård av försöksdjur. I detta protokoll användes koldioxid (CO2) inandning som metod för eutanasi.- Dissekera råttan på bukperitoneumnivån med pincett och sax. Extrahera livmodern med E18-embryona och placera den i en 10 cm skål som har kylts på is.
OBS: Det är viktigt att undvika att råtthåren fäster vid embryona. Det rekommenderas att använda rikliga mängder 70% etanol för att sterilisera buken. Från detta steg och framåt, arbeta inuti huven på isbricka 1. - Öppna embryonala säckar och överför embryona till 10 cm skålen med HBSS, se till att embryona är helt nedsänkta.
- Ta bort embryohuvudet med sax och lägg det i 6 cm skålen med HBSS. Upprepa denna process med alla embryon.
OBS: För att undvika kontaminering ska all vävnad utom embryohuvudena kasseras i en behållare med skruvlock. - Håll embryohuvudet med finböjda tångar och genomborra banorna med ett par fina raka pincett, gå in i 45 ° vinkel och släpp sedan de finböjda tångarna.
Tången får inte gå igenom hjärnan, så det är viktigt att behålla vinkeln när du går in. - Dissekera huden och skallen med operationssaxen, från det occipitala benet till frontbenet. Ta bort hjärnan med ett par finböjda pincett och lägg den i 6 cm skålen med viloläge + B27. Upprepa denna process tills alla hjärnor har återhämtat sig.
- Sagittally separera telencefalonerna med de fina raka pincettarna.
OBS: Från och med detta steg utförs dissektion av hippocampus under ett stereomikroskop. Det rekommenderas att använda ledade lampor så att ljuset belyser dissektionsytan från sidorna. Det rekommenderas också att använda en svart bakgrund eftersom detta ger mer kontrast, vilket gör det möjligt att bättre skilja hippocampus. - Förbered en 10 cm skål genom att placera droppar Hibernate + B27 på 1 cm avstånd (t.ex. i en cirkel). Placera en telencephalon per droppe Hibernate + B27 och visualisera genom dissekeringsomfånget (1,25x objektiv förstoring rekommenderas).
- Skala försiktigt hjärnhinnorna och ta bort thalamus för att bättre visualisera hippocampus.
- Dissekera hippocampus med precisionsfjädersaxen och placera den i 3,5 cm skålen med Hibernate + B27 i isbricka 2. Upprepa för varje telencephalon tills alla hippocampi är samlade.
- Samla försiktigt alla hippocampi med en Pasteur-pipett och överför dem till ett 50 ml rör.
OBS: Ta minsta volym av Hibernate + B27 när du samlar hippocampi för att inte späda trypsinet.
- Dissekera råttan på bukperitoneumnivån med pincett och sax. Extrahera livmodern med E18-embryona och placera den i en 10 cm skål som har kylts på is.
- Celldissociation
- Enzymatisk dissociation av hippocampus
- I 50 ml röret som innehåller hippocampi, tillsätt 1 ml 2,5% trypsin och bringa det till en 5 ml volym med HBSS. Inkubera i 15 minuter i vattenbadet vid 37 °C.
- För att späda ut trypsinet, tillsätt 10 ml förvärmd HBSS och inkubera i 5 minuter i vattenbadet vid 37 °C.
- Överför hippocampi som nu uppträder som en slemmassa till ett 50 ml rör med en 1 000 μl mikropipett, tillsätt 6 ml förvärmd HBSS och inkubera i 5 minuter i vattenbadet vid 37 °C.
- Mekanisk dissociation av hippocampus
- Överför massan till ett 2 ml rör med konisk botten och ta den minimala volymen. Tillsätt 1 ml förvärmd DMEM-media. Homogenisera pelleten med en 1 000 μl mikropipett genom att försiktigt aspirera upp och ner.
OBS: Det är viktigt att undvika att generera bubblor när man aspirerar eftersom bubblor kan lysera cellerna. - Upprepa upp- och nedaspirationen med en fördragen glaspipett (10x-20x), med spetsen i kontakt med rörets koniska botten. Undvik att generera bubblor. I slutet av detta steg måste blandningen vara genomskinlig.
- När blandningen är homogent blandad så att blandningen är genomskinlig, överför den till ett rör som innehåller 4 ml DMEM-medier vid 37 °C och homogenisera med en glaspipett genom pipettering upp och ner.
- Överför massan till ett 2 ml rör med konisk botten och ta den minimala volymen. Tillsätt 1 ml förvärmd DMEM-media. Homogenisera pelleten med en 1 000 μl mikropipett genom att försiktigt aspirera upp och ner.
- Enzymatisk dissociation av hippocampus
- Cell sådd
- Räkna cellerna. Antalet neuroner i lösningen kan räknas enligt standardlaboratorieprocedurer.
OBS: I avbildningsexperiment för antikroppsdetektering och kalciumaktivitet är en koncentration av 50 000 celler per 3,5 cm skål optimal. - Håll cellerna upphängda, dra ut den beräknade volymen och plåta i 3,5 cm skålar som innehåller PLL-belagda täckglas eller i de PLL-belagda glasbottenfaten.
- Fördela cellerna jämnt på diskarna genom att mjukt skaka i korsade rörelser (fram och tillbaka, sedan sida till sida, upprepa efter behov) och placera diskarna i CO2 (5%) inkubatorn.
OBS: Det är viktigt att använda korsade rörelser för att undvika att cellerna sätter sig i skålens periferi. - Lägg till cirka 1 ml NB + B27 varje vecka, så att kulturen inte torkar.
OBS: Efter 2 veckor (14 dagar in vitro [div]) är neuronerna mogna och uttrycker alla faktorer som ska användas för experiment. Det totala genomsnittliga antalet neuroner som erhållits med hjälp av detta protokoll är ungefär 2,5 x 106 neuroner som kommer från i genomsnitt 12 E18-embryon per gravid råtta.
- Räkna cellerna. Antalet neuroner i lösningen kan räknas enligt standardlaboratorieprocedurer.
DEL 2: Användning av hippocampus neuronala kulturer för antikroppsdetektion i neuronala cellytproteiner
OBS: Denna del av protokollet visar hur hippocampuskulturer används för att identifiera anti-NMDAR-antikroppar i serum och / eller CSF hos patienter med anti-NMDAR-encefalit. Fluorescerande immunfärgning används för att visualisera reaktiviteten i de levande neuronerna, men andra visualiseringsmetoder kan också användas. En lämplig kontroll för detta experiment skulle vara serum eller CSF från en frisk individ. När du använder mänskliga prover, kom ihåg att godkännande från den institutionella etiska kommittén kan krävas.
3. Levande fluorescerande immunfärgning
- Använd 14 div-celler som har odlats på täckglas (50 000 celler per 3,5 cm skål som innehåller fem täckglas).
- Skölj täckglasen inuti huven med NB förvärmd till 37 °C.
- Lägg till det prov som i detta fall innehåller anti-NMDAR-antikroppar (används som primär antikropp) utspädda i NB-media vid 1:200 för serum eller 1:2 för CSF och inkubera 1 h vid 37 °C (inuti CO2 (5%) inkubatorn).
- Skölj försiktigt med PBS 3x vid RT.
- Tillsätt fixeringslösning (4% formaldehyd i PBS) och inkubera vid RT i 5 min.
VARNING: Vid hantering av 4% formaldehyd, arbeta inuti huven och använd rekommenderad personlig skyddsutrustning. - Tvätta 3x med PBS i 5 min vardera.
- Tillsätt sekundär antikropp Get anti-Human AF488 vid 1:1000 utspädning och inkubera vid RT i 1 timme.
OBS: Under inkubationen, skydda mot ljusexponering genom att täcka med aluminiumfolie. - Tvätta 3x med PBS i 5 min vardera. Skölj med destillerat vatten
- Montera täckglasen med ett flytande monteringsmedium (t.ex. antifading-monteringsmedium med DAPI; cirka 7 μL), aspirera eventuell kvarvarande vätska och skölj med destillerat vatten. Neuronerna är nu redo för fluorescensavbildning.
VARNING: Vid hantering av monteringsmedium, använd den rekommenderade personliga skyddsutrustningen.
DEL 3: Demonstration av antikroppspatogena effekter med kalciumavbildning
OBS: Denna del av protokollet visar hur man avgör om antikropparna hos patienter har en funktionell effekt på kulturerna, vilket skulle föreslå patogenicitet. För att öka effekternas betydelse användes en pool av CSF från åtta patienter. Kalciumaktiviteten hos de levande kulturerna registrerades vid kemisk stimulering (NMDA + glycin) med användning av GECI-fluorescenskalciumindikatorn (GCaMP5G). Dessa studier kräver ett inverterat fluorescensmikroskop med en cellkammare som kan upprätthålla de nödvändiga fysiologiska förhållandena hos neuronerna.
4. Kalciumavbildning
- Använd 14-18 divceller som har odlats på täckglas (50 000 celler per 3,5 cm skål med fem täckblad)
- 1 vecka före avbildning, tillsätt virusvektorn pAAV2-CAG-GCaMP5G vid 2,5 x 1010 GC / ml till cellerna och inkubera i 5-7 dagar.
OBS: Denna kommersiellt tillgängliga, färdigförpackade AAV serotyp 2-vektor uttrycker genetiskt kodad kalciumindikator GCaMP5G under en CAG-promotor. - 1 dag före avbildning, tillsätt patientprovet (i det här exemplet en pool av CSF utspädd 1:25 i NB + B27) och inkubera i 24 timmar. Filtrera alltid mänskliga prover (0,2 μm porstorlek) före användning för att undvika kontaminering.
OBS: För dessa studier måste kontroll CSF från friska försökspersoner köras parallellt. - På avbildningsdagen, förbered avbildningsinställningen och ställ in mikroskopcellkammaren till 37 ° C, fyll körfältet med destillerat vatten och infusera med 5%CO2 för att upprätthålla cellfysiologiska förhållanden.
- Tvätta cellerna från steg 3 i huven med 3 ml EPS förvärmd till 37 °C
- Täck cellerna med 2,45 ml EPS och överför dem till mikroskopcellkammaren. Lägg till NBQX (10 μM) för att blockera AMPA- och KA-receptorerna för att visualisera uteslutande NMDA-receptorsvaret.
- I det inverterade fluorescensmikroskopet utrustat med en kvicksilverlampa och en FITC-filterkub, skaffa en 2 min film med ramar inspelade var 100: e ms (spontan aktivitet).
OBS: Ett 20x NA 0.75 luftmål användes och bilder (512 x 512 pixlar, 16-bitars gråskala) togs var 100: e ms med en sCMOS-kamera. - Skaffa den andra filmen på 4 min med ramar inspelade var 100: e ms. Strax efter att förvärvet har påbörjats, tillsätt stimuleringslösning (NMDA [100 μM] + glycin [1 μM]) till skålen.
OBS: Tillsatsen av media i skålen kommer att generera turbulens som kan störa bildförhållandena (fokus, fluorescensintensitet och / eller ospecifik bakgrundssignal). Tillsätt inte mer än 50 μl lösning i den fyllda 2,5 ml skålen för att minska sannolikheten för sådana förändringar. - Med hjälp av bildbehandlingsprogramvara (ImageJ användes här), extrahera fluorescenssignalen över tiden, erhållen vid stimulering, från de kulturer som inkuberas med patienten och kontrollera CSF-prover.
OBS: GCaMP-sonderna, när de binder till fria kalciumjoner, genomgår en konformationsförändring som gör att de blir ljusare. Därför korrelerar ökningen av fluorescensintensiteten med en kalciuminflöde på grund av neuronal depolarisering. - Bestäm de regioner av intresse (ROI) som ska analyseras. Segmentera somas av neuroner manuellt och lägg till ROIs till ROI-chefen (Analysera > Tools > ROI Manager > Lägg till). Spara ROI från ROI Manager-menyn (Mer > spara).
- Ställ in mätningarna (Analysera > Ange mått) och välj medelvärdet för gråton. Extrahera profilen för genomsnittlig fluorescensintensitet från cellsomorna genom att klicka på Mer > Multimått och spara sedan tabellen som genereras som ett .xls kalkylblad.
- Utföra statistiska analyser för att jämföra fluorescensen mellan grupper (patienternas CSF kontra kontrollens CSF).
Representative Results
Etablering av dissocierade, foster-, gnagare hippocampala neuronala kulturer
Protokollet som presenteras här är baserat på de inflytelserika studierna om nervcellsodling utförda av Banker och Goslin15. Protokollet har förfinats för att erhålla neuronala kulturer med optimal morfologi, densitet och renhet för att utföra neuronala ytantikroppsdetekteringsstudier. Protokollet för dissektion och sådd är uppdelat i tre delar (figur 1A). Den första delen, hippocampusisoleringen, består av kirurgisk extraktion av den levande vävnaden (figur 1A, vänster panel). Som framgår av figuren är dräktiga Wistar-råttor med E18-embryon det viktigaste utgångsmaterialet för en framgångsrik kultur. När hjärnan har extraherats från E18-embryona utförs mikrokirurgi under ett stereomikroskop. Med lämpliga verktyg (figur 1B) och exakt hantering är det möjligt att separera hippocampus från resten av nervvävnaden. Dispositionen av vävnader i det specifika mediet visas i figur 1C. Den andra delen av protokollet består av hippocampuscelldissociationen. Den är indelad i två steg (Figur 1A, mittpanelen): enzymatisk dissociation och mekanisk dissociation av hippocampus, vilket resulterar i intakta, dissocierade, enskilda celler. Med hjälp av denna metod är det möjligt att erhålla cellkulturer utan cellaggregat, som representeras i figur 2A-D. Den tredje delen av protokollet består av cellsådden (figur 1A, höger panel). Denna del av protokollet är avgörande för att justera densiteten och homogeniteten hos neuronkulturen i plattan. Att räkna cellerna och sådda 50 000 neuroner i ett område med en 3,5 cm skål ger en optimal densitet för att utföra inte bara experiment för att bestämma närvaron av antikroppar mot neuronala cellytproteiner (Figur 3) utan också för att analysera patogeniciteten hos dessa antikroppar med kalciumavbildning (Figur 4).
Figur 1: Visuellt protokoll för primära kulturer av hippocampusneuroner. A) Flödesschema som visar de tre delarna av protokollet för beredning av dissocierade cellkulturer av hippocampusneuroner från embryonala råttor vid E18. Protokollet är indelat i 1. Hippocampus isolering, 2. Celldissociation och 3. Cell sådd. (B) Urval av rekommenderade verktyg för hippocampusisolering grupperade i tre kategorier: (1- Tång, 2- Böjda tångar, 3- Sax) för embryosamling, (4- Finböjda tångar, 5- Fin-raka pincett, 6- Kirurgisax) för hjärnextraktion och (7- Finvinklade tångar, 8- Precisionsfjädersax) för hippocampusisolering. (C) Schematisk representation av isbricka 1 med plattor och media som behövs för hippocampusisoleringen. Embryon och huvuden placeras i HBSS, medan hjärnor placeras i viloläge + B27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kulturer av hippocampusneuroner vid 18 div är mogna, sammankopplade och uttrycker strukturella och funktionella proteiner
Vid tillväxt och mognad av neuronala kulturer kan två differentierade faser uppskattas: neuronens polarisationsfas (figur 2A,B) och fasen av dendritisk utveckling och konstruktion av det synaptiska nätverket (figur 2C,D). Celler på 1 div är jämnt fördelade och har fäst vid plattan och utvecklat en lamell runt cellkroppen med mindre neuriter som börjar sträcka sig (figur 2A). Efter några dagar i kulturen sträcker sig neuriterna ett kort avstånd. Celler visar en signifikant polarisering, men det finns liten nettotillväxt (figur 2B). Efter detta stadium är synaptogenes framträdande, och neuronerna börjar kopplas samman. Det neuronala nätverket fortsätter att växa och blir mer komplext (figur 2C). Vid 18 div är neuroner mogna och sammankopplade; det neuronala nätverket är byggt (figur 2D). När de synaptiska ryggraden har bildats och anslutits är neuroner helt polariserade och uttrycker alla funktionella och strukturella proteiner. Av de många proteiner som uttrycks av mogna odlade neuroner har neuronreceptorn NMDA (figur 2E) och det synaptiska proteinet PSD95 (figur 2F) valts här som representativa markörer. Dessutom är det möjligt att selektivt visualisera axoner genom att märka neurofilament (NF) (Figur 2G) och visualisera dendriter genom att rikta in sig på MAP2-proteinet (Figur 2H).
Figur 2: Tidsförlopp för mognad av dissocierade cellkulturer av hippocampusneuroner. (A-D) Faskontrastbilder av hippocampusneuroner under de första 18 dagarna av kulturen. (A) Neuroner vid 1 div vid fastsättning på det PLL-belagda substratet. (B) Framväxten av små neuriter i neuroner vid 5 div. (C) Neuroner vid 11 div har utvecklat långa neuriter som förlängs och förvärvar axonala egenskaper. (D) Neuroner vid 18 div är mogna och har bildat ett neuralt nätverk. Skalstreck (A-D) = 40 μm. (E-H) Representativa fluorescerande bilder tagna med konfokal laserskanningsmikroskopi med hjälp av selektiva markörer för att visa mogna neuroner vid 18 div. Neuronala kulturer fixerades och immunfärgades med antikroppar som selektivt fläckar för (E) neuronal receptor (NMDAR), (F) synaptisk markör (PSD95), (G) axonal markör (neurofilament, NF) och (H) dendritisk markör (MAP2). Skalstreck (E-H) = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Antikroppar i patientprover reagerar med neuronala cellyteantigener
Proverna (serum och CSF) erhållna från patienter som har anti-NMDAR-encefalit innehåller autoantikroppar som känner igen NMDAR som finns på ytan av neuroner. Inkubation av kulturerna med patientproverna ger en intensiv fluorescenssignal på cellytan och dendriter (figur 3A,C). Däremot producerar kontrollprover ingen fluorescenssignal när de administreras till neuronala kulturer (figur 3B,D). Dessa resultat visar hur kulturerna kan användas för att screena patientprover för antikroppar och kan leda till identifiering av nya antikroppar som riktar sig mot den neuronala cellytan.
CSF-prov från patienten minskar den intracellulära kalciumkoncentrationen i NMDA-inducerade kulturer av hippocampusneuroner
För att utvärdera effekten av patienternas antikroppar på den neurala aktiviteten (efter 24 timmars behandling) övervakades intracellulära kalciumtransienter optiskt från de odlade neuronerna i realtid vid NMDA-medierad stimulering. Tillämpningen av NMDA genererar en ökning av fluorescensintensiteten, vilket indikeras av en förändring i den intracellulära gröna fluorescensen (figur 4A och kompletterande video 1). Neuroner som behandlades med kontroll-CSF-provet visade en högre skillnad i fluorescensintensitet (56%) när stimulatorn applicerades jämfört med cellerna som behandlades med patientens CSF-prov. Skillnaderna i fluorescensintensitet mättes och de NMDA-medierade stimuleringskurvorna från data extraherade från cellernas soma jämfördes (figur 4B,C). Stimuleringskurvorna visar att det fanns en intracellulär tillströmning av kalcium i båda scenarierna, men de kulturer som behandlades med patienternas CSF (grå linje) visade ett lägre svar än de kontrollbehandlade kulturerna (svart linje). Dessa resultat visar att de antikroppar som finns i patienternas CSF minskar den cellulära aktiviteten på grund av antikropparnas interaktion med NMDAR och därmed orsakar en patogen effekt.
Figur 3: Patientantikroppar reagerar med ytan av neuronala kulturer . (A,E) Serum och CSF från patienter med anti-NMDAR-encefalit reagerar med cellytan hos levande råtta hippocampusneuroner, (B,F) medan serumet och CSF från kontrollpersoner inte visar någon reaktivitet. Skalstreck (A,B,E,F) = 20 μm. Bild av högre förstoring av en dendrit (63x) som visar det typiska ytmönstret för reaktivitet för (C,G) patientens serum och CSF och (D,H) negativt för kontroller. Bilderna togs med konfokal laserscanningsmikroskopi. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Patientantikroppar minskar kalciuminflödet i råttneuroner som uttrycker GCaMP5G. (A) Administrering av stimuleringslösning (NMDA [100 μM] + glycin [1 μM]) i kulturer av neuroner utlöste en kalciumtillströmning, vilket indikeras av ökande intracellulär grön fluorescens (stimuleringstopp), jämfört med bilden som togs före stimuleringen (förstimulering). Efter 120 s minskar fluorescensintensiteten och stabiliseras (efterstimulering). Kulturer som behandlades med patienternas CSF visade en signifikant minskning (56%) av den NMDA-medierade kalciumökningen jämfört med kontrollens CSF. Bilderna togs med fluorescensmikroskopi. Skalstreck = 20 μm. (B) En plot av ett av de tre oberoende experimenten som representerar fluorescensintensiteten över tid (180 s) för de kulturer som behandlas med kontrollens CSF (svart linje) och patienternas CSF (grå linje) vid NMDA-stimulering (blå pil). n(Kontrollernas CSF) = 20 celler; n(Patienternas CSF) = 28 celler. Data representeras som medelvärde ± SEM. (C) Boxdiagram visar median-, 25- och 75:e percentilerna. Whiskers anger minimi- och maximivärdena. Bedömning av signifikans utfördes genom tvåvägsanalys av varians (ANOVA; p < 0,0001) och Mann-Whitney U-tester (p < 0,0001). Ett värde på p < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: Video som visar två hippocampusneuroner som uttrycker GCaMP5G sida vid sida: neuron behandlad med kontrollens CSF (vänster) kontra neuron behandlad med patienternas CSF (höger). Tillämpningen av NMDAR (stimulering) genererar en ökning av intracellulär fluorescensintensitet i båda fallen, men med en signifikant högre nivå i neuronen som behandlas med kontrollens CSF jämfört med den som behandlas med patienternas CSF. Bilderna togs med fluorescensmikroskopi och redigerades med ImageJ med hjälp av uppslagstabellen (LUT) Fire. 1700 ramar (170 s); accelererad 5 gånger. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det växande fältet av antikroppsmedierad autoimmunitet har öppnat ett fönster av möjligheter för identifiering av neuronala autoantikroppar som kan användas för att förbättra diagnos och behandling av patienter. Kulturer av hippocampusneuroner är ett viktigt verktyg för identifiering av antikroppar; Därför är det viktigt att utföra ett standardiserat protokoll för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. De viktigaste stegen att tänka på, begränsningar och felsökning diskuteras här.
De kritiska stegen i detta protokoll kan grupperas i tre kategorier beroende på om de påverkar renheten, homogeniteten eller livskraften hos hippocampusneuronerna.
Renhet - För att få optimala primära cellkulturer måste utredaren vara säker, utbildad och kunna arbeta snabbt, särskilt för att minimera dissektionstiden. Även om pyramidala neuroner är den huvudsakliga celltypen, innehåller hippocampus en mängd olika interneuroner14. För att generera kulturer med minimala gliaceller måste hippocampus extraheras med den minimala omgivande vävnaden. Användningen av en svart bakgrund under dissektion hjälper till att identifiera gränserna för hippocampus under stereomikroskopet. Dessutom bör det beaktas att lägre celltätheter resulterar i mindre parakrint stöd och gör det svårare att upprätthålla kulturen13. Så det är viktigt att ha denna balans i åtanke. Detta är viktigt i bildstudier som använder ett lågt antal celler (50 000 neuroner per 3,5 cm skål). För att kunna få ytterligare tid för hippocampusextraktionen bör viloläge som bevarar vävnaden användas17. Att arbeta med adekvata kirurgiska verktyg är också viktigt. Verktyg med hög precision är känsliga, så teknikens reproducerbarhet bör säkerställas genom att noggrant skydda dem.
Homogenitet - För att utveckla en kultur utan cellaggregat har den mekaniska celldissociationen uppgraderats genom att kombinera användningen av en fördragen glaspipett med en standard 1,000 μL pipett.
Viabilitet - I detta protokoll tillsattes inga antibiotika eftersom de påverkar neuronal excitabilitet och förändrar de elektrofysiologiska egenskaperna hos de odlade neuronerna18. Därför är kontaminering mycket sannolikt om de högsta standarderna för sterilitet inte upprätthålls. Temperaturen är också en nyckelfaktor. Att hålla vävnaden kall under hippocampusisoleringen saktar ner ämnesomsättningen och minskar cellnedbrytningen. Vävnaden hölls därför på is tills celldissociationsprocessen. Dessutom är det viktigt att hitta rätt balans under den enzymatiska celldissociationen som disaggregerar cellerna utan markerad celllys. I detta protokoll har tidpunkterna för inkubation med trypsin och de efterföljande tvättstegen optimerats för att erhålla enskilda celler med tillräckligt med utrymme för att möjliggöra skapandet av ett lämpligt neuronalt nätverk.
Kritiska steg finns också i fluorescerande levande immunfärgning och kalciumaktivitetsinspelningar från neuronala kulturer. För att utföra framgångsrik levande immunfärgning för att bestämma närvaron av antikroppar mot cellytproteiner i patientprover måste man undvika permeabilisering av cellerna som skulle ge antikropparna tillgång till intracellulära proteiner. Baserat på antikropparnas titer måste dessutom inkubationstiden och provutspädningen justeras i enlighet med detta (t.ex. kan mycket höga titerantikroppar ge bakgrundsfärgning som gör det svårt att tolka resultaten). När man utför patogenicitetsbedömningen av autoantikropparna med kalciumavbildning måste man använda ett medium som är optimalt för cellulära aktivitetsmätningar (t.ex. är Mg2+ undertryckande i odlingsmediet viktigt för god prestanda). För fluorescensavbildning bör dessutom media med pH-indikatorer som fenolrött undvikas eftersom det introducerar en ospecifik bakgrundssignal.
Det finns två huvudsakliga begränsningar av användningen av hippocampus neuronala kulturer. För det första, jämfört med stabila cellinjer, måste primära kulturer genereras kontinuerligt, vilket innebär att laboratoriedjur används regelbundet. Inducerade pluripotenta stamcellslinjer (iPSC) skulle kunna ersätta behovet av att använda djurmodeller, men differentieringsprotokollen för iPSC är fortfarande inte optimala. För det andra uttrycker neuroner härledda från iPSC inte de fullständiga spektra av ytproteiner och därför, om de används, innebär frånvaron av reaktivitet inte nödvändigtvis negativiteten hos provet19.
Det finns tre metoder för att screena för närvaron av autoantikroppar i serumet eller CSF hos patienter som misstänks ha AE: vävnadsbaserad analys (TBA) med hjälp av råtthjärnvävnad, cellbaserad analys (CBA) med HEK-celler transfekterade för att uttrycka neuronala proteiner, och applikationen rapporterad här med levande kulturer av hippocampusneuroner19. Betydelsen av den odlade hippocampala neuronmetoden ligger i dess förmåga att differentiera reaktivitet med yt- och intracellulära antigener som inte lätt kan särskiljas av TBA. Dessutom är primära neuronala kulturer, till skillnad från CBA i HEK-transfekterade celler, inte begränsade av repertoaren av transfekterade proteiner. Dessutom kan odlade hippocampusneuroner användas för att identifiera nya antikroppar och deras målantigener i kombination med immunoprecipitation och masspektrometri och därför bredda spektrumet av identifierbara antikroppar. Slutligen möjliggör det bedömning av de patogena effekterna av autoantikropparna genom levande avbildningsmetoder som kan övervaka förändringar i cellulär aktivitet. Sammanfattningsvis möjliggör identifieringen av nya autoantikroppar så småningom initiering av specifika immunterapier för att förbättra patientresultaten.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann och Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) och Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp och Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Barcelonas universitet) för deras tekniska support och för tillhandahållande av reagenser, och Josep Dalmau och Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Barcelonas universitet) för deras kritiska granskning av manuskriptet och mentorskapet. Denna studie finansierades av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) och medfinansierades av Europeiska unionen, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa-programmet för kompetenscentrum inom FoU (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programmet och Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); och Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
| 12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Beaker 100 mL | Pirex | - | |
| Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Curved forceps | FST | 11009-13 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
| Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | - | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
| Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
| Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
| FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
| Forceps | FST | 11000-12 | |
| Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
| Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
| Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | - | |
| Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | - | |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
| L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
| Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
| Microscope cell chamber | Custom-build | - | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| NBQX | Tocris | 373 | |
| Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | - | |
| Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
| Polystyrene ice tray | - | - | re-used cap of a polysterene box |
| Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
| ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
| Scissors | FST | 14068-12 | |
| Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
| Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
| Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system. Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).
- Dalmau, J., Graus, F.
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti- N -methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Annals of Neurology. 61 (1), 25-36 (2007).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurology. 7 (12), 1091-1098 (2008).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Annals of Neurology. 65, 424-434 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABAB receptor in limbic encephalitis with seizures: case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurology. 9 (1), 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurology. 9 (8), 776-785 (2010).
- Sabater, L., et al. A novel NREM and REM parasomnia with sleep breathing disorder associated with antibodies against IgLON5: a case series, pathological features, and characterization of the antigen. Lancet Neurology. 13 (6), 575-586 (2014).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. The Journal of Neuroscience. 30 (17), 5866-5875 (2010).
- Moscato, E. H., et al. Acute mechanisms underlying antibody effects in anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis. Annals of Neurology. 76 (1), 108-119 (2014).
- Planagumà, J., et al. Human N-methyl D-aspartate receptor antibodies alter memory and behaviour in mice. Brain. 138 (1), 94-109 (2015).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Benson, D. L., Watkins, F. H., Steward, O., Banker, G. Characterization of GABAergic neurons in hippocampal cell cultures. Journal of Neurocytology. 23 (5), 279-295 (1994).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. (1998).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. Journal of Visualized Experiments. (19), e895 (2008).
- Brewer, G. J., Price, P. J. Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month. Neuroreport. 7 (9), 1509-1512 (1996).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).
- Ricken, G., et al. Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis. Frontiers in Neurology. 9, 841 (2018).
