इस पांडुलिपि का लक्ष्य किटV558Δ/+ माउस मॉडल और माउस नमूनों के सफल विच्छेदन और प्रसंस्करण के लिए तकनीकों का वर्णन करना है।
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी) सबसे आम मानव सारकोमा है और आमतौर पर केआईटी रिसेप्टर में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालित होता है। ट्यूमर प्रकारों में, कैंसर उपचार की अगली पीढ़ी की जांच करने के लिए कई माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, जीआईएसटी में, विवो अध्ययनों में अधिकांश ज़ेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करते हैं जिनकी अंतर्निहित सीमाएं हैं। यहां, हम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर के एक प्रतिरक्षात्मक, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का वर्णन करते हैं जो किटवी 558Δ / + उत्परिवर्तन को आश्रय देता है। इस मॉडल में, उत्परिवर्ती केआईटी, अधिकांश जीआईएसटी के लिए जिम्मेदार ऑन्कोजीन, इसके अंतर्जात प्रमोटर द्वारा संचालित होता है जो जीआईएसटी में देखी गई हिस्टोलॉजिकल उपस्थिति और प्रतिरक्षा घुसपैठ की नकल करता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग लक्षित आणविक और प्रतिरक्षा उपचार दोनों की जांच के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। यहां, हम एक किटV558Δ/+ माउस कॉलोनी के प्रजनन और रखरखाव का वर्णन करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह पेपर जीआईएसटी के उपचार और खरीद का विवरण देता है, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड को सूखा देता है, और किटवी 558Δ/+ चूहों में आसन्न सीकम, साथ ही आणविक और इम्यूनोलॉजिकल विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी करता है।
जीआईएसटी संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 6,000 मामलों की घटनाओं के साथ मनुष्यों में सबसे आम सारकोमाहै 1. जीआईएसटी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पेसमेकर कोशिकाओं से उत्पन्न होता है जिसे काजल की अंतरालीय कोशिकाओं का नाम दिया जाता है, और आमतौर पर टायरोसिन किनेज किट या पीडीजीएफआरए 2 में एक एकल उत्परिवर्तन द्वारा संचालितहोता है। सर्जरी जीआईएसटी के लिए उपचार का मुख्य आधार है और उपचारात्मक हो सकती है, लेकिन उन्नत बीमारी वाले रोगियों का इलाज टायरोसिन किनेज इनहिबिटर (टीकेआई), इमाटिनिब के साथ किया जा सकता है। 20 साल पहले इसकी शुरुआत के बाद से, इमातिनिब ने जीआईएसटी में उपचार प्रतिमान को बदल दिया है, उन्नत बीमारी में जीवित रहने में सुधार 1 से 5 साल 3,4,5 तक। दुर्भाग्य से, अधिग्रहित किट उत्परिवर्तन के कारण इमैटिनिब शायद ही कभी उपचारात्मक होता है, इसलिए इस ट्यूमर के लिए नए उपचार की आवश्यकता होती है।
माउस मॉडल कैंसर में उपन्यास चिकित्सा की जांच में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं। जीआईएसटी 6,7 में कई चमड़े के नीचे के ज़ेनोग्राफ्ट और रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल विकसित और जांच की गई है। हालांकि, इम्यूनोडेफिशिएंट चूहे पूरी तरह से मानव जीआईएसटी का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं क्योंकि जीआईएसटी अपने ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन के आधार पर अंतर प्रतिरक्षा प्रोफाइल को बंद करते हैं, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बदलने से टीकेआई थेरेपी 8,9 के प्रभावमें सुधार होता है। + माउस में किट एक्सॉन 11 में एक विषमयुग्मजी जर्मलाइन विलोपन है, जो मानव जीआईएसटी10 में सबसे अधिक उत्परिवर्तित साइट जक्सटामेम्ब्रेन डोमेन को एन्कोड करता है। + चूहों में 100% प्रवेश के साथ एक एकल सीकल जीआईएसटी विकसित होता है, और ट्यूमर में मानव जीआईएसटी 8,11,12,13 के समान ऊतक विज्ञान, आणविक सिग्नलिंग, प्रतिरक्षा घुसपैठ और चिकित्सा की प्रतिक्रिया होती है। यहां, हम जीआईएसटी में आणविक और इम्यूनोलॉजिकल अनुसंधान में उपयोग के लिए किटवी 558Δ/+ चूहों में प्रजनन, उपचार और नमूना अलगाव और प्रसंस्करण का वर्णन करते हैं।
किट V558Δ/+ माउस मॉडल जीआईएसटी के आणविक और प्रतिरक्षाविज्ञानी विश्लेषण में एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण है। यद्यपि प्रजनन रणनीति को एक एकल क्रॉस की आवश्यकता होती है, ट्यूमर प्रतिक्रिया का विश्ले?…
The authors have nothing to disclose.
किट V558Δ/+ चूहों को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर किया गया था और डॉ पीटर बेसमर10 द्वारा साझा किया गया था। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 01 सीए 102613 और टी 32 सीए 251063 द्वारा समर्थित किया गया था।
100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
vivaCT 80 platform | Scanco medical |