消化管間質腫瘍の遺伝子操作マウスモデルにおける分子および免疫学的技術
Summary
この原稿の目的は、 KitV558Δ/+マウスモデルと、マウス標本の解剖と処理を成功させるための技術を説明することです。
Abstract
胃腸間質腫瘍(GIST)は最も一般的なヒト肉腫であり、典型的にはKIT受容体の単一の変異によって駆動される。腫瘍の種類を超えて、次世代のがん治療法を調査するために、多数のマウスモデルが開発されてきた。しかし、GISTでは、ほとんどの in vivo 研究は、固有の制限を有する異種移植マウスモデルを使用する。ここでは、 KitV558Δ/+ 変異を保有する消化管間質腫瘍の免疫能を有する遺伝子操作マウスモデルについて説明する。このモデルでは、ほとんどのGISTの原因となる癌遺伝子である変異KITは、その内因性プロモーターによって駆動され、ヒトGISTに見られる組織学的外観および免疫浸潤を模倣するGISTにつながる。さらに、このモデルは、標的分子療法と免疫療法の両方を調査するために首尾よく使用されています。ここでは、 キットV558Δ/+ マウスコロニーの飼育と維持について述べる。さらに、この論文では、 KitV558Δ/+ マウスにおけるGISTの治療と調達、腸間膜リンパ節の排出、隣接する盲腸、ならびに分子および免疫学的分析のためのサンプル調製について詳述します。
Introduction
GISTはヒトで最も一般的な肉腫であり、米国では約6,000例の発生率を有する1。GISTは、Cajalの間質細胞と名付けられた胃腸ペースメーカー細胞に由来するようであり、典型的にはチロシンキナーゼKITまたはPDGFRA2の単一の変異によって駆動される。手術はGISTの治療の柱であり、治癒的であり得るが、進行した疾患を有する患者は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)、イマチニブで治療することができる。20年以上前に導入されて以来、イマチニブはGISTの治療パラダイムを変革し、進行した疾患の生存率を1年から5年以上に改善しました3,4,5。残念なことに、イマチニブは後天的なKIT変異のために治癒することはめったにないので、この腫瘍には新しい治療法が必要です。
マウスモデルは、がんにおける新規治療法の調査において重要な研究ツールである。複数の皮下異種移植片および患者由来異種移植片モデルが開発され、GIST6,7で調査されている。しかし、GISTは発癌性変異に応じて異なる免疫プロファイルを保有し、胃腸腫瘍微小環境の変化はTKI療法の効果を改善するため、免疫不全マウスはヒトGISTを完全には表していない8,9。KitV558Δ/+マウスは、ヒトGIST 10で最も一般的に変異した部位である並膜ドメインをコードするキットエクソン11においてヘテロ接合性生殖細胞系列欠失を有する。キットV558Δ/+マウスは、100%の浸透率を有する単一の盲腸GISTを発達させ、腫瘍はヒトGIST 8,11,12,13と同様の組織学、分子シグナル伝達、免疫浸潤、および治療に対する応答を有する。ここでは、GISTの分子・免疫学的研究に用いるキットV558Δ/+マウスの育種・治療・検体の単離・処理について述べる。
Protocol
すべてのマウスを、NIHガイドラインに従い、ペンシルベニア大学IACUCの承認を得て、ペンシルベニア大学で病原体を含まない条件下で飼育した。安楽死は、ペンシルベニア大学実験動物資源の標準作業手順に従って実施した。 1. キットV558Δ/+ マウス飼育 C57BL/6Jマウスを用いて 、キットV558Δ/+ マウス?…
Representative Results
KitV558Δ/+マウスモデルは、免疫適格マウスモデルにおける治療薬の調査を可能にします。キットV558Δ/+マウスの平均寿命は、進行性の腸閉塞により8ヶ月である(図4)。KitV558Δ/+マウスの腫瘍は、チロシンキナーゼKITおよび膜貫通チャネルDOG1(図5)、ならびに転写因子ETV1(図</stro…
Discussion
KitV558Δ/+ マウスモデルは、GIST の分子および免疫学的解析における強力な研究ツールです。育種戦略では単一の交配が必要ですが、腫瘍応答を分析する実験でKitV558Δ/+マウスコホートを使用するには、広範な交配が必要です。マウスは、同様の腫瘍重量を確保するために年齢と性別が一致している必要があり、腫瘍が確立された8週齢前にマウスの10%が死亡する。C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
キットV558Δ/+ マウスは遺伝子操作され、Peter Besmer10博士によって共有されました。この作業は、NIHの助成金R01 CA102613およびT32 CA251063によって支援されました。
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
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Cite This Article
Tieniber, A. D., Hanna, A. N., Do, K., Wang, L., Rossi, F., DeMatteo, R. P. Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor. J. Vis. Exp. (183), e63853, doi:10.3791/63853 (2022).