Ex Vivo Organoidmodel af adenovirus-cre-medierede gendeletninger i museurtelceller
Summary
Denne protokol beskriver processen med generering og karakterisering af muse urotheliale organoider, der indeholder deletioner i gener af interesse. Metoderne omfatter høst af muse urothelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus, der driver Cre-ekspression med en CMV-promotor, og in vitro – såvel som in vivo-karakterisering .
Abstract
Blærekræft er et underundersøgt område, især i genetisk manipulerede musemodeller (GEMM’er). Indavlede GEMM’er med vævsspecifikke Cre- og loxP-steder har været guldstandarderne for betinget eller inducerbar genmålretning. For at give hurtigere og mere effektive eksperimentelle modeller udvikles et ex vivo organoidkultursystem ved hjælp af adenovirus Cre og normale urotelceller, der bærer flere loxP-alleler af tumorsuppressorerne Trp53, Pten og Rb1. Normale urothelceller adskilles enzymatisk fra fire blærer af triple floxed mus (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). Urotelcellerne transduceres ex vivo med adenovirus-Cre drevet af en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerede blæreorganoider dyrkes, formeres og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR bruges til at bekræfte gendeletninger i Trp53, Pten og Rb1. Immunofluorescens (IF) farvning af organoider viser positiv ekspression af urothelial afstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoiderne injiceres subkutant i værtsmus til tumorudvidelse og serielle passager. Immunohistokemien (IHC) af xenografts udviser positiv ekspression af CK7, CK5 og p63 og negativ ekspression af CK8 og Uroplakin 3. Sammenfattende er adenovirusmedieret gendeletning fra museurtelceller konstrueret med loxP-steder en effektiv metode til hurtigt at teste det tumorigene potentiale af definerede genetiske ændringer.
Introduction
Blærekræft er den fjerde mest almindelige kræft hos mænd og rammer mere end 80.000 mennesker årligt i USA1. Platinbaseret kemoterapi har været standardbehandling for patienter med fremskreden blærekræft i mere end tre årtier. Landskabet af blærekræftbehandling er blevet revolutioneret af den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun checkpoint hæmmere), erdafitinib (en fibroblast vækstfaktor receptor inhibitor) og enfortumab vedotin (et antistof-lægemiddel konjugat) 2,3,4. Der findes dog ingen klinisk godkendte biomarkører til at forudsige responsen på kemoterapi eller immunterapi. Der er et kritisk behov for at generere informative prækliniske modeller, der kan forbedre forståelsen af de mekanismer, der driver blærekræftprogression og udvikle prædiktive biomarkører for forskellige behandlingsmetoder.
En stor hindring i blære translationel forskning er manglen på prækliniske modeller, der rekapitulerer human blærekræftpatogenese og behandlingsrespons 5,6. Der er udviklet flere prækliniske modeller, herunder in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerede celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-udskrivning) og in vivo-modeller (xenograft, kræftfremkaldende, genetisk manipulerede modeller og patientafledt xenograft)2,6. Gensplejsede musemodeller (GEMM’er) er nyttige til mange anvendelser inden for blærekræftbiologi, herunder analyser af tumorfænotyper, mekanistiske undersøgelser af kandidatgener og/eller signalveje og præklinisk evaluering af terapeutiske responser 6,7. GEMM’er kan anvende stedsspecifikke rekombinaser (Cre-loxP) til at kontrollere genetiske deletioner i et eller flere tumorsuppressorgener. Processen med at generere ønskede GEMM’er med flere gendeletninger er tidskrævende, besværlig og dyr5. Det overordnede mål med denne metode er at udvikle en hurtig og effektiv metode til ex vivo Cre-levering til etablering af blære triple knockout (TKO) modeller fra normale muse urothelceller, der bærer tredobbelt floxede alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordel ved ex vivo-metoden er den hurtige arbejdsgang (1-2 uger i stedet for mange års museavl). Denne artikel beskriver protokollen for høst af normale urothelceller med floxerede alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer og in vitro– og in vivo-karakterisering i immunkompetente C57 BL / 6J-mus. Denne metode kan yderligere anvendes til at generere klinisk relevante blærekræftorganoider i immunkompetente mus, der huser enhver kombination af floxede alleler.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM’er har været guldstandarderne for kræftmodellering initieret fra normale celler, hvilket gør det muligt at teste konsekvenserne af potentielle onkogene forstyrrelser (onkogenaktivering og / eller tab af tumorsuppressorer) grundigt. Her tilvejebringes en hurtig og effektiv protokol til at generere blærekræftorganoider via ex vivo-genredigering af normale museurtelceller, der bærer floxede alleler i gener af interesse. H & E og IHC farvning viser, at TKO-organoider udviser histologi i overensstemmelse m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsarbejde blev delvist støttet af NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
