Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli
Summary
Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.
Abstract
Mesane kanseri, özellikle genetiği değiştirilmiş fare modellerinde (GEMM’ler) az çalışılmış bir alandır. Dokuya özgü Cre ve loxP bölgelerine sahip inbred GEMM’ler, koşullu veya indüklenebilir gen hedeflemesi için altın standartlar olmuştur. Daha hızlı ve daha verimli deneysel modeller sağlamak için, adenovirüs Cre ve tümör baskılayıcıları Trp53, Pten ve Rb1’in çoklu loxP alellerini taşıyan normal ürotelyal hücreler kullanılarak bir ex vivo organoid kültür sistemi geliştirilmiştir. Normal ürotelyal hücreler, üçlü flokslu farelerin dört mesanesinden enzimatik olarak ayrılır (Trp53 f / f: Pten f / f: Rb1 f / f). Ürotelyal hücreler, bir CMV promotörü (Ad5CMVCre) tarafından tahrik edilen adenovirüs-Cre ile ex vivo olarak dönüştürülür. Transdüke mesane organoidleri kültürlenir, yayılır ve in vitro ve in vivo olarak karakterize edilir. PCR, Trp53, Pten ve Rb1’deki gen delesyonlarını doğrulamak için kullanılır. Organoidlerin immünofloresan (IF) boyanması, ürotelyal soy belirteçlerinin (CK5 ve p63) pozitif ekspresyonunu gösterir. Organoidler, tümör genişlemesi ve seri pasajlar için konakçı farelere deri altından enjekte edilir. Ksenogreftlerin immünohistokimyası (IHC), CK7, CK5 ve p63’ün pozitif ekspresyonunu ve CK8 ve Uroplakin 3’ün negatif ekspresyonunu sergiler. Özetle, loxP bölgeleri ile tasarlanmış fare ürotelyal hücrelerinden adenovirüs aracılı gen delesyonu, tanımlanmış genetik değişikliklerin tümörojenik potansiyelini hızlı bir şekilde test etmek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Mesane kanseri erkeklerde dördüncü en sık görülen kanserdir ve Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 80.000’den fazla insanı etkilemektedir1. Platin bazlı kemoterapi, otuz yıldan fazla bir süredir ilerlemiş mesane kanseri olan hastalar için standart bakım olmuştur. Mesane kanseri tedavisinin manzarası, immünoterapi (anti-PD-1 ve anti-PD-L1 immün kontrol noktası inhibitörleri), erdafitinib (bir fibroblast büyüme faktörü reseptör inhibitörü) ve enfortumab vedotin (bir antikor-ilaç konjugat) 2,3,4’ün son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onayı ile devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, kemoterapi veya immünoterapiye yanıtları tahmin etmek için klinik olarak onaylanmış biyobelirteçler mevcut değildir. Mesane kanseri progresyonunu yönlendiren mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilecek ve farklı tedavi modaliteleri için prediktif biyobelirteçler geliştirebilecek bilgilendirici preklinik modeller üretmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Mesane translasyonel araştırmalarında önemli bir engel, insan mesane kanseri patogenezini ve tedavi yanıtlarını özetleyen preklinik modellerin bulunmamasıdır 5,6. İn vitro 2D modeller (hücre hatları veya şartlı olarak yeniden programlanmış hücreler), in vitro 3D modeller (organoidler, 3D baskı) ve in vivo modeller (ksenogreft, kanserojen kaynaklı, genetik olarak tasarlanmış modeller ve hasta kaynaklı ksenograft) dahil olmak üzere çoklu klinik öncesi modeller geliştirilmiştir2,6. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMM’ler), tümör fenotiplerinin analizleri, aday genlerin ve / veya sinyal yolaklarının mekanik araştırmaları ve terapötik yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi dahil olmak üzere mesane kanseri biyolojisindeki birçok uygulama için yararlıdır 6,7. GEMM’ler, bir veya daha fazla tümör baskılayıcı gendeki genetik delesyonları kontrol etmek için bölgeye özgü rekombinazları (Cre-loxP) kullanabilir. Çoklu gen delesyonları ile istenen GEM’leri üretme süreci zaman alıcı, zahmetli ve pahalıdır5. Bu yöntemin genel amacı, üçlü flokslu aleller (Trp53, Pten ve Rb1)8 taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinden mesane üçlü nakavt (TKO) modellerinin oluşturulması için hızlı ve etkili bir ex vivo Cre dağıtım yöntemi geliştirmektir. Exvivo yönteminin en büyük avantajı hızlı iş akışıdır (yıllarca fare yetiştiriciliği yerine 1-2 hafta). Bu makalede, immünkompetan C57 BL/6J farelerde floksed aleller, ex vivo adenovirüs transdüksiyonu, organoid kültürler ve in vitro ve in vivo karakterizasyon ile normal ürotelyal hücrelerin toplanması için protokol anlatılmaktadır. Bu yöntem, floksed alellerin herhangi bir kombinasyonunu barındıran immünkompetan farelerde klinik olarak ilgili mesane kanseri organoidleri üretmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM’ler, normal hücrelerden başlatılan kanser modellemesi için altın standartlar olmuştur ve potansiyel onkojenik pertürbasyonların (onkogen aktivasyonu ve / veya tümör baskılayıcıların kaybı) sonuçlarının titizlikle test edilmesini sağlar. Burada, ilgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidlerinin üretilmesi için hızlı ve etkili bir protokol sağlanmaktadır. H&E ve IHC boyaması, TKO organoi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma çalışması kısmen NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ve R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibesi), Roswell Park Alliance Vakfı ve Üroloji Dostları Vakfı tarafından desteklenmiştir. Marisa Blask ve Mila Pakhomova’ya makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
