Denne protokollen beskriver prosessen med generering og karakterisering av mus urothelial organoider som skjuler slettinger i gener av interesse. Metodene inkluderer høsting av mus urothelial celler, ex vivo transduksjon med adenovirus kjøring Cre uttrykk med en CMV promotør, og in vitro samt in vivo karakterisering.
Blærekreft er et undervurdert område, spesielt i genmodifiserte musemodeller (GEMMs). Innavlede GEMMs med vevsspesifikke Cre- og loxP-nettsteder har vært gullstandardene for betinget eller inducible genmålretting. For å gi raskere og mer effektive eksperimentelle modeller, utvikles et ex vivo organoid kultursystem ved hjelp av adenovirus Cre og normale urothelialceller som bærer flere loxP-alleler av tumordemperne Trp53, Pten og Rb1. Normale urotelceller er enzymatisk disassosiert fra fire blærer med trippel floxed mus (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). De urotheliale cellene transduseres ex vivo med adenovirus-Cre drevet av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transinduserte blæreorganoidene dyrkes, forplantes og karakteriseres in vitro og in vivo. PCR brukes til å bekrefte gensletting i Trp53, Pten og Rb1. Immunfluorescens (IF) farging av organoider viser positivt uttrykk for uroteliale avstamningsmarkører (CK5 og p63). Organoidene injiseres subkutant i vertsmus for tumorutvidelse og serielle passasjer. Immunhistokjemien (IHC) av xenografts viser positivt uttrykk for CK7, CK5 og p63 og negativt uttrykk for CK8 og Uroplakin 3. Oppsummert er adenovirusmediert gensletting fra mus urothelialceller konstruert med loxP-nettsteder en effektiv metode for raskt å teste det tumorigeniske potensialet til definerte genetiske endringer.
Blærekreft er den fjerde vanligste kreftformen hos menn og rammer mer enn 80.000 mennesker årlig i USA1. Platinabasert kjemoterapi har vært standarden for omsorg for pasienter med avansert blærekreft i mer enn tre tiår. Landskapet av blærekreft behandling har blitt revolusjonert av den nylige Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av immunterapi (anti-PD-1 og anti-PD-L1 immun sjekkpunkthemmere), erdafitinib (en fibroblast vekstfaktor reseptor inhibitor) og enfortumab vedotin (en antistoff-narkotika konjugat)2,3,4. Imidlertid er ingen klinisk godkjente biomarkører tilgjengelige for å forutsi responsen på kjemoterapi eller immunterapi. Det er et kritisk behov for å generere informative prekliniske modeller som kan forbedre forståelsen av mekanismene som driver blærekreftprogresjonen og utvikle prediktive biomarkører for ulike behandlingsmodaliteter.
Et stort hinder i blæreoversettelsesforskning er mangelen på prekliniske modeller som rekapitulerer human blærekreftpatogenese og behandlingsresponser 5,6. Flere prekliniske modeller er utviklet, inkludert in vitro 2D-modeller (cellelinjer eller betinget omprogrammerte celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) og in vivo-modeller (xenograft, kreftfremkallende, genetisk konstruerte modeller og pasientavledede xenograft)2,6. Genmodifiserte musemodeller (GEMMs) er nyttige for mange anvendelser innen blærekreftbiologi, inkludert analyser av tumorfenotyper, mekanistiske undersøkelser av kandidatgener og/eller signalveier, og den prekliniske evalueringen av terapeutiske responser 6,7. GEMMs kan bruke stedsspesifikke rekombininaer (Cre-loxP) for å kontrollere genetiske slettinger i ett eller flere tumordempergener. Prosessen med å generere ønskede GEMMs med flere genslettinger er tidkrevende, arbeidskrevende ogdyrt 5. Det overordnede målet med denne metoden er å utvikle en rask og effektiv metode for ex vivo Cre-levering for å etablere blære trippel knockout (TKO) modeller fra normale mus urothelialceller som bærer trippel floxed alleler (Trp53, Pten og Rb1)8. Den største fordelen med ex vivo-metoden er den raske arbeidsflyten (1-2 uker i stedet for år med museavl). Denne artikkelen beskriver protokollen for høsting av normale urotelceller med floxed alleler, ex vivo adenovirustransduksjon, organoide kulturer og in vitro og in vivo-karakterisering i immunokortogene C57 BL/6J-mus. Denne metoden kan videre brukes til å generere klinisk relevante blærekreftorganoider i immunompetente mus som skjuler enhver kombinasjon av floxed alleler.
GEMMs har vært gullstandardene for kreftmodellering initiert fra normale celler, slik at konsekvensene av potensielle onkogene perturbasjoner (oncogene aktivering og / eller tap av tumordempere) kan testes grundig. Her gis en rask og effektiv protokoll for å generere blærekreftorganoider via ex vivo genredigering av normale mus urothelialceller som bærer floxed alleler i gener av interesse. H&E- og IHC-farging viser at TKO-organoider viser histologi i samsvar med høyverdig urothelial urothelium, med squamou…
The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsarbeidet ble delvis støttet av NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162 og R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation og Friends of Urology Foundation. Vi takker Marisa Blask og Mila Pakhomova for korrekturlesing av manuskriptet.
100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
1 mL syringe | BD | 309659 | |
25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |