Ex Vivo Organoidmodell av adenovirus-kreiterade genraderingar i musurotelceller
Summary
Detta protokoll beskriver processen för generering och karakterisering av musuroteliala organoider som hyser deletioner i gener av intresse. Metoderna inkluderar skörd av musurotelceller, ex vivo-transduktion med adenovirus som driver Cre-uttryck med en CMV-promotor och in vitro såväl som in vivo-karakterisering .
Abstract
Blåscancer är ett understuderat område, särskilt i genetiskt modifierade musmodeller (GEMM). Inavlade GEMM med vävnadsspecifika Cre- och loxP-platser har varit guldstandarden för villkorlig eller inducerbar geninriktning. För att ge snabbare och effektivare experimentella modeller utvecklas ett ex vivo organoidodlingssystem med adenovirus Cre och normala urotelceller som bär flera loxP-alleler av tumörsuppressorerna Trp53, Pten och Rb1. Normala urotelceller avlägsnas enzymatiskt från fyra blåsor av trippel floxerade möss (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). De uroteliala cellerna transduceras ex vivo med adenovirus-Cre som drivs av en CMV-promotor (Ad5CMVCre). De transducerade blåsorganoiderna odlas, förökas och karakteriseras in vitro och in vivo. PCR används för att bekräfta genraderingar i Trp53, Pten och Rb1. Immunofluorescens (IF) färgning av organoider visar positivt uttryck av uroteliala härstamningsmarkörer (CK5 och p63). Organoiderna injiceras subkutant i värdmöss för tumörutvidgning och seriella passager. Immunohistokemin (IHC) hos xenografter uppvisar positivt uttryck av CK7, CK5 och p63 och negativt uttryck av CK8 och Uroplakin 3. Sammanfattningsvis är adenovirusmedierad genradering från musurotelceller konstruerade med loxP-platser en effektiv metod för att snabbt testa den tumörogena potentialen hos definierade genetiska förändringar.
Introduction
Blåscancer är den fjärde vanligaste cancerformen hos män och drabbar mer än 80 000 personer årligen i USA1. Platinabaserad kemoterapi har varit vårdstandarden för patienter med avancerad blåscancer i mer än tre decennier. Landskapet för behandling av blåscancer har revolutionerats av det senaste Godkännandet av Food and Drug Administration (FDA) av immunterapi (anti-PD-1 och anti-PD-L1 immunkontrollpunktshämmare), erdafitinib (en fibroblasttillväxtfaktorreceptorhämmare) och enfortumab vedotin (ett antikropps-läkemedelskonjugat)2,3,4. Det finns dock inga kliniskt godkända biomarkörer tillgängliga för att förutsäga svaren på kemoterapi eller immunterapi. Det finns ett kritiskt behov av att generera informativa prekliniska modeller som kan förbättra förståelsen för de mekanismer som driver utvecklingen av urinblåsecancer och utveckla prediktiva biomarkörer för olika behandlingsmetoder.
Ett stort hinder i blåstranslationsforskning är bristen på prekliniska modeller som rekapitulerar human blåscancerpatogenes och behandlingssvar 5,6. Flera prekliniska modeller har utvecklats, inklusive in vitro 2D-modeller (cellinjer eller villkorligt omprogrammerade celler), in vitro 3D-modeller (organoider, 3D-utskrift) och in vivo-modeller (xenograft, cancerframkallande, genetiskt modifierade modeller och patient-härledd xenograft)2,6. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) är användbara för många tillämpningar inom blåscancerbiologi, inklusive analyser av tumörfenotyper, mekanistiska undersökningar av kandidatgener och / eller signalvägar och preklinisk utvärdering av terapeutiska svar 6,7. GEMM kan använda platsspecifika rekombinaser (Cre-loxP) för att kontrollera genetiska deletioner i en eller flera tumörsuppressorgener. Processen att generera önskade GEMM med flera genraderingar är tidskrävande, mödosam och dyr5. Det övergripande målet med denna metod är att utveckla en snabb och effektiv metod för ex vivo Cre-leverans för att etablera TKO-modeller (bladder triple knockout) från normala mus-urotelceller som bär trippel floxerade alleler (Trp53, Pten och Rb1)8. Den stora fördelen med ex vivo-metoden är det snabba arbetsflödet (1-2 veckor istället för år av musavel). Denna artikel beskriver protokollet för skörd av normala urotelceller med floxerade alleler, ex vivo adenovirustransduktion, organoidkulturer och in vitro– och in vivo-karakterisering hos immunkompetenta C57 BL / 6J-möss. Denna metod kan vidare användas för att generera kliniskt relevanta organoider av blåscancer hos immunkompetenta möss som hyser någon kombination av floxerade alleler.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM har varit guldstandarderna för cancermodellering initierad från normala celler, vilket gör att konsekvenserna av potentiella onkogena störningar (onkogen aktivering och / eller förlust av tumörsuppressorer) kan testas noggrant. Här tillhandahålls ett snabbt och effektivt protokoll för att generera organoider av blåscancer via ex vivo-genredigering av normala musuroteliala celler som bär floxerade alleler i gener av intresse. H&E- och IHC-färgning visar att TKO-organoider uppvisar histologi som ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta forskningsarbete stöddes delvis av NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 och R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation och Friends of Urology Foundation. Vi tackar Marisa Blask och Mila Pakhomova för korrekturläsningen av manuskriptet.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
