Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis
Summary
Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.
Abstract
Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten – im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.
Introduction
Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt – und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie molekulare Einheiten funktionieren, müssen ihre Struktur und Funktion gemeinsam untersucht werden.
Jüngste Fortschritte bei der Herstellung von Materialien wie atomar dünnem Graphen oder siliziumbasierten Mikrochips bieten neue Möglichkeiten für die Echtzeit-Strukturfunktionsanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs). Diese Materialien können hermetisch abgeschlossene Kammern für die Live-EM-Bildgebung 6,7,8,9,10,11 erzeugen. Das neue Feld der Flüssig-EM, die Raumtemperatur korreliert mit Kryo-EM, bietet beispiellose Ansichten von harten oder weichen Materialien in Lösung, so dass Wissenschaftler gleichzeitig die Struktur und Dynamik ihrer Probe untersuchen können. Flüssig-EM-Anwendungen umfassen Echtzeitaufnahmen von therapeutischen Nanopartikeln, die mit Krebsstammzellen interagieren, sowie Veränderungen in den molekularen Feinheiten viraler Krankheitserreger12,13,14.
So wie methodische Fortschritte die Auflösungsrevolution im Kryo-EM-Bereich vorangetrieben haben, sind neue Techniken und Methoden erforderlich, um den Einsatz von Flüssig-EM als Hochdurchsatzwerkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft zu erweitern. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Protokolle zur Vorbereitung von Flüssig-EM-Proben zu rationalisieren. Der Grund für die entwickelten Techniken ist der Einsatz neuer Mikrochip-Designs und Autoloader-Geräte, die sowohl für die Datenerfassung von Flüssigkeiten als auch für Kryo-EM geeignet sind (Abbildung 1)7,14,15,16,17). Die Baugruppen werden mechanisch mit Standard-Rasterclips für automatisierte Instrumente wie dem Krios versiegelt, der mehrere Proben pro Sitzung aufnehmen kann, oder einem F200C TEM (Abbildung 2). Diese Methodik erweitert den Einsatz hochauflösender Bildgebung über Standard-Kryo-EM-Anwendungen hinaus und demonstriert breitere Zwecke für die Echtzeit-Materialanalyse.
Im aktuellen Videoartikel werden Protokolle zur Herstellung von Virusbaugruppen in Flüssigkeit mit und ohne handelsübliche Probenhalter vorgestellt. Mit dem speziellen Probenhalter für Flüssig-EM können dünnflüssige Proben strukturelle Informationen liefern, die mit Kryo-EM-Proben vergleichbar sind, sowie dynamische Einblicke in die Proben. Demonstriert werden auch Methoden zur Vorbereitung flüssiger Proben mit Autoloader-Werkzeugen für Hochdurchsatzroutinen. Der große Vorteil gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass die automatisierte Probenproduktion es dem Benutzer ermöglicht, seine Proben vor der Datenerfassung schnell auf optimale Dicke und Elektronendosierung zu beurteilen. Diese Screening-Technik identifiziert schnell ideale Bereiche für Echtzeitaufnahmen in Flüssigkeit oder Eis12,14,18,19. Für die Zwecke der 3D-Strukturbestimmung kann Liquid-EM die seit langem etablierten Kryo-EM-Methoden ergänzen, die in Kryo-EM implementiert sind. Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Verwendung von Flüssig-EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue, dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise bereitzustellen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt.
Zu den in diesem Protokoll verwendeten Virusproben gehören gereinigte adenoassoziierte Virussubtypen 3 (AAV), die als Geschenk gewonnen und unter Standardbedingungen kultiviertwerden 12. Ebenfalls verwendet wurden nicht-infektiöse subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus dem Serum von COVID-19-Patienten12 gewonnen und aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden. Schließlich wurden gereinigte Affenrotavirus (SA11-Stamm) Doppelschichtpartikel (DLPs) aus dem Labor von Dr. Sarah M. McDonald Esstman an der Wake Forest University gewonnen und unter Standardbedingungen 6,17 kultiviert. Die hier beschriebenen Softwarepakete sind frei verfügbar und die Links wurden im Abschnitt Materialverzeichnis bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoeb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Abteilung für Augenheilkunde) für die Bereitstellung von gereinigtem AAV-3. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health und dem National Cancer Institute unterstützt (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 an D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
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