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Biology

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Published: September 09, 2022
doi:
10.3791/63866
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1Putuo People’s Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology,Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital,Fudan University

Summary

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune típica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e dano axonal. Atualmente, não há medidas para curar completamente a EM, mas várias terapias modificadoras da doença (DMT) estão disponíveis para controlar e mitigar a progressão da doença. Existem semelhanças significativas entre as características patológicas do SNC da encefalomielite autoimune experimental (EAE) e pacientes com EM. O EAE tem sido amplamente utilizado como um modelo representativo para determinar a eficácia dos medicamentos para EM e explorar o desenvolvimento de novas terapias para a doença da EM. A indução ativa de EAE em camundongos tem um efeito estável e reprodutível e é particularmente adequada para estudar os efeitos de drogas ou genes na neuroinflamação autoimune. O método de imunização de camundongos C57BL/6J com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e a avaliação diária dos sintomas da doença usando um sistema de pontuação clínica são compartilhados principalmente. Dada a complexa etiologia da SM com diversas manifestações clínicas, o sistema de pontuação clínica existente não pode satisfazer a avaliação do tratamento da doença. Para evitar as deficiências de uma única intervenção, novos indicadores para avaliar EAE com base nas manifestações clínicas de humor semelhante à ansiedade e osteoporose em pacientes com EM são criados para fornecer uma avaliação mais abrangente do tratamento da EM.

Introduction

As doenças autoimunes são um espectro de distúrbios causados pela resposta imune do sistema imunológico aos seus próprios antígenos, resultando em danos ou disfunção tecidual1. A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica de polineuropatia no sistema nervoso central (SNC), caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e degeneração axonal neuronal 2,3. Atualmente, a EM afetou até 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente jovens e pessoas de meia-idade com idades entre 20 e 40 anos, que são muitas vezes a espinha dorsal de suas famílias e da sociedade. Isso tem causado considerável impacto e danos às famílias e à sociedade 2,4.

A SM é uma doença multifatorial com manifestações clínicas diversas e complexas. Além dos distúrbios neurológicos clássicos caracterizados por infiltração inflamatória e desmielinização, a SM frequentemente apresenta deficiência visual, discinesia de membros e distúrbios cognitivos e emocionais 5,6,7. Se os pacientes com EM não receberem o tratamento adequado e correto, metade deles viverá em cadeiras de rodas após 20 anos, e quase metade deles experimentará sintomas depressivos e de ansiedade, levando a níveis muito mais elevados de ideação suicida do que a população em geral 8,9.

Apesar de um longo período de pesquisa, a etiologia da EM permanece indescritível, e a patogênese da EM ainda não foi elucidada. Modelos animais de EM permitiram servir como ferramentas de teste para explorar o desenvolvimento de doenças e novas abordagens terapêuticas, apesar das diferenças significativas entre os sistemas imunológico de roedores e humanos, ao mesmo tempo em que compartilhavam alguns princípios básicos. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é atualmente o modelo animal ideal para o estudo da EM, que usa a imunidade de autoantígenos das proteínas da mielina para induzir a autoimunidade aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis, com a adição de adjuvante de Freund completo (CFA) e toxina pertussis (PTX) para melhorar a resposta imune humoral. Dependendo do contexto genético e dos antígenos imunológicos, diferentes processos patológicos, incluindo agudos, remitentes-recorrentes ou crônicos, são obtidos para mimetizar várias formas clínicas de SM10,11,12. Os imunógenos relevantes comumente usados na construção de modelos EAE vêm de proteínas do auto-SNC, como a proteína básica de mielina (MBP), a proteína proteolipídica (PLP) ou a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG). Camundongos SJL/L imunizados com MBP ou PLP desenvolvem um curso remitente-recorrente, e o MOG desencadeia EAE crônica progressiva em camundongos C57BL/611,12,13.

O principal objetivo da terapia modificadora da doença (DMT) é minimizar os sintomas da doença e melhorar a função6. Várias drogas são usadas clinicamente para aliviar a EM, mas nenhuma droga ainda foi usada para curá-la completamente, revelando a necessidade de tratamento sinérgico. Os camundongos C57BL/6 são atualmente os mais comumente utilizados para a construção de camundongos transgênicos e, neste trabalho, um modelo EAE induzido pelo MOG35-55 em camundongos C57BL/6J com uma escala de 5 pontos foi usado para monitorar a progressão da doença. Os modelos EAE também sofrem de humor semelhante à ansiedade e perda óssea, e as lesões desmielinizantes amplamente conhecidas. Aqui, o método para avaliar os sintomas de EAE a partir de múltiplas perspectivas usando teste de campo aberto e análise de tomografia micro-computadorizada (Micro-CT) também é descrito.

Protocol

O Comitê de Cuidados com os Animais da Universidade de Tongji aprovou o presente trabalho, e todas as diretrizes de cuidados com os animais foram seguidas. Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas entre 8-12 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Garantiu-se que a idade e o sexo fossem os mesmos nos grupos experimentais; caso contrário, a suscetibilidade à doença foi afetada. Os camundongos foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos com ciclos alternados de 12 h de luz e escuridão s…

Representative Results

Após a imunização dos camundongos, o peso corporal dos camundongos é registrado diariamente, e seus sintomas clínicos são avaliados de acordo com o protocolo descrito acima (etapa 4). Em camundongos C57BL / 6J imunizados com peptídeo MOG, porque a localização da lesão está confinada principalmente à medula espinhal, a patogênese dos camundongos EAE se espalha da extremidade da cauda até a cabeça. No início da doença, os camundongos EAE exibem fraqueza e queda da cauda, seguidos por fraqueza dos membros p…

Discussion

A SM é uma doença inflamatória desmielinizante do SNC e é um dos distúrbios neurológicos mais comuns causadores de incapacidade crônica em jovens, impondo um enorme fardo às famílias e à sociedade 3,4. A SM sempre foi classificada como uma doença autoimune mediada por células T específicas de órgãos, induzindo o sistema autoimune a corroer lentamente o SNC, o que envolverá múltiplos sistemas em todo o corpo27. Os sintomas …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e do State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland
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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).
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