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Biology

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Published: September 09, 2022
doi:
10.3791/63866
, , , , , , , , , , ,
1Putuo People’s Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology,Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital,Fudan University

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Abstract

Multiple Sklerose (MS) ist eine typische Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und axonale Schäden gekennzeichnet ist. Derzeit gibt es keine Maßnahmen, um MS vollständig zu heilen, aber mehrere krankheitsmodifizierende Therapien (DMT) sind verfügbar, um das Fortschreiten der Krankheit zu kontrollieren und zu mildern. Es gibt signifikante Ähnlichkeiten zwischen den pathologischen Merkmalen des ZNS der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und MS-Patienten. EAE wurde häufig als repräsentatives Modell verwendet, um die Wirksamkeit von MS-Medikamenten zu bestimmen und die Entwicklung neuer Therapien für MS-Erkrankungen zu untersuchen. Die aktive Induktion von EAE bei Mäusen hat eine stabile und reproduzierbare Wirkung und eignet sich besonders für die Untersuchung der Auswirkungen von Medikamenten oder Genen auf autoimmune Neuroinflammation. Die Methode der Immunisierung von C57BL/6J-Mäusen mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und die tägliche Beurteilung der Krankheitssymptome mittels eines klinischen Scoring-Systems wird hauptsächlich geteilt. Angesichts der komplexen Ätiologie der MS mit verschiedenen klinischen Manifestationen kann das bestehende klinische Bewertungssystem die Bewertung der Krankheitsbehandlung nicht erfüllen. Um die Mängel einer einzelnen Intervention zu vermeiden, werden neue Indikatoren zur Beurteilung der EAE basierend auf klinischen Manifestationen von angstähnlichen Stimmungen und Osteoporose bei MS-Patienten erstellt, um eine umfassendere Bewertung der MS-Behandlung zu ermöglichen.

Introduction

Autoimmunerkrankungen sind ein Spektrum von Erkrankungen, die durch die Immunantwort des Immunsystems auf seine eigenen Antigene verursacht werden, was zu Gewebeschäden oder Funktionsstörungen führt1. Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung der Polyneuropathie im zentralen Nervensystem (ZNS), gekennzeichnet durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und neuronale axonale Degeneration 2,3. Derzeit sind weltweit bis zu 2,5 Millionen Menschen von MS betroffen, vor allem junge und Menschen mittleren Alters im Alter von 20 bis 40 Jahren, die oft das Rückgrat ihrer Familien und der Gesellschaft bilden. Dies hat erhebliche Auswirkungen und Schäden für Familien und die Gesellschaft verursacht 2,4.

MS ist eine multifaktorielle Erkrankung mit vielfältigen und komplexen klinischen Manifestationen. Neben klassischen neurologischen Erkrankungen, die durch entzündliche Infiltration und Demyelinisierung gekennzeichnet sind, zeigt MS häufig Sehstörungen, Gliedmaßendyskinesie sowie kognitive und emotionale Störungen 5,6,7. Wenn MS-Patienten nicht die richtige und korrekte Behandlung erhalten, wird die Hälfte von ihnen nach 20 Jahren im Rollstuhl leben, und fast die Hälfte von ihnen wird depressive und Angstsymptome haben, was zu einem viel höheren Maß an Suizidgedanken führt als die Allgemeinbevölkerung 8,9.

Trotz einer langen Forschungszeit bleibt die Ätiologie der MS schwer fassbar, und die Pathogenese der MS ist noch nicht aufgeklärt. Tiermodelle von MS haben es ermöglicht, als Testwerkzeuge zu dienen, um die Krankheitsentwicklung und neue therapeutische Ansätze zu erforschen, trotz der signifikanten Unterschiede zwischen dem Nagetier- und dem menschlichen Immunsystem, während gleichzeitig einige Grundprinzipien geteilt werden. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist derzeit das ideale Tiermodell für die Untersuchung von MS, das Autoantigen-Immunität von Myelinproteinen verwendet, um Autoimmunität gegen ZNS-Komponenten in anfälligen Mäusen zu induzieren, mit dem Zusatz von vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) und Keuchhustentoxin (PTX), um die humorale Immunantwort zu verstärken. Abhängig vom genetischen Hintergrund und den Immunantigenen werden verschiedene Krankheitsprozesse, einschließlich akuter, schubförmig-remittierender oder chronischer, erhalten, um verschiedene klinische Formen von MS10,11,12 nachzuahmen. Die relevanten Immunogene, die üblicherweise bei der Konstruktion von EAE-Modellen verwendet werden, stammen aus Selbst-ZNS-Proteinen wie Myelin-Basisprotein (MBP), Proteolipidprotein (PLP) oder Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). MBP- oder PLP-immunisierte SJL/L-Mäuse entwickeln einen schubförmig-remittierenden Verlauf, und MOG löst chronisch progrediente EAE bei C57BL/6-Mäusenaus 11,12,13.

Der Hauptzweck der krankheitsmodifizierenden Therapie (DMT) besteht darin, Krankheitssymptome zu minimieren und die Funktion zu verbessern6. Mehrere Medikamente werden klinisch zur Linderung von MS eingesetzt, aber noch wurde kein Medikament verwendet, um es vollständig zu heilen, was die Notwendigkeit einer synergistischen Behandlung aufzeigt. C57BL / 6-Mäuse werden derzeit am häufigsten verwendet, um transgene Mäuse zu konstruieren, und in dieser Arbeit wurde ein EAE-Modell, das durch MOG35-55 in C57BL / 6J-Mäusen mit einer 5-Punkte-Skala induziert wurde, verwendet, um das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. EAE-Modelle leiden auch unter angstähnlichen Stimmungen und Knochenschwund sowie den weithin bekannten demyelinisierenden Läsionen. Hier wird auch die Methode beschrieben, die Symptome der EAE aus mehreren Perspektiven mittels Freifeldtest und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) zu beurteilen.

Protocol

Das Tierpflegekomitee der Tongji-Universität genehmigte die vorliegende Arbeit und alle Richtlinien für die Tierpflege wurden befolgt. Für die Experimente wurden männliche oder weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen verwendet. Es wurde sichergestellt, dass Alter und Geschlecht in den Versuchsgruppen gleich waren; Andernfalls war die Anfälligkeit für die Krankheit beeinträchtigt. Die Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung mit abwechselnden 12 h Hell- und Dunkelzyklen unter …

Representative Results

Nach der Immunisierung der Mäuse wird das Körpergewicht der Mäuse täglich aufgezeichnet und ihre klinischen Symptome werden gemäß dem oben beschriebenen Protokoll (Schritt 4) bewertet. Bei C57BL / 6J-Mäusen, die mit MOG-Peptid immunisiert wurden, breitet sich die Pathogenese der EAE-Mäuse vom Schwanzende bis zum Kopf aus, da die Läsion hauptsächlich auf das Rückenmark beschränkt ist. Zu Beginn der Krankheit zeigen EAE-Mäuse Schwäche und Herabhängen des Schwanzes, gefolgt von Schwäche der Hintergliedmaßen…

Discussion

MS ist eine demyelinisierende entzündliche Erkrankung des ZNS und eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die bei jungen Menschen chronische Behinderungen verursachen und Familien und Gesellschaft enorm belasten 3,4. MS wurde schon immer als organspezifische T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung klassifiziert, die das Autoimmunsystem dazu veranlasst, das ZNS langsam zu erodieren, was mehrere Systeme im ganzen Körper betrifft27…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) und das State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland
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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).
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