Иммуномаркировка и подсчет синапсов ленты у молодых взрослых и возрастных песчанок Cochleae
Summary
Представлен протокол обработки молодых взрослых и возрастных улиток песчанок путем иммуномаркировки афферентных синаптических структур и волосковых клеток, гашения автофлуоресценции в стареющей ткани, рассечения и оценки длины улиток и количественной оценки синапсов в стеках изображений, полученных с помощью конфокальной визуализации.
Abstract
Предполагается, что потеря ленточных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки и афферентные слуховые нервные волокна, является одной из причин возрастной потери слуха. Наиболее распространенным методом обнаружения потери ленточных синапсов является иммуномаркировка, поскольку она позволяет проводить количественный отбор проб из нескольких тонотопных мест в отдельной улитке. Тем не менее, структуры, представляющие интерес, похоронены глубоко внутри костистой улитки. Песчанки используются в качестве животной модели для возрастной потери слуха. Здесь описаны рутинные протоколы фиксации, иммуномаркировки кохлеарных целых креплений песчанки, конфокальной визуализации и количественной оценки количества и объемов синапсов ленты. Кроме того, подчеркиваются особые проблемы, связанные с получением хорошего материала от ценных стареющих людей.
Песчанки усыпляются и либо перфузируются сердечно-сосудисто, либо их барабанные буллы тщательно рассекаются из черепа. Улитки вскрываются на вершине и основании и непосредственно переносятся на фиксатор. Независимо от первоначального метода, улитки постфиксируются и впоследствии декальцифицируются. Затем ткань маркируется первичными антителами против пре- и постсинаптических структур и волосковых клеток. Затем улитки инкубируются со вторичными флуоресцентными антителами, которые специфичны по отношению к их соответствующим первичным. Улитки старых песчанок затем обрабатывают автофлуоресцентным гасителем, чтобы уменьшить типично существенную фоновую флуоресценцию тканей пожилых животных.
Наконец, улитки рассечены на 6-11 сегментов. Вся длина кохлеара реконструируется таким образом, что конкретные кохлеарные места могут быть надежно определены между особями. Конфокальные стеки изображений, полученные последовательно, помогают визуализировать волосковые клетки и синапсы в выбранных местах. Конфокальные стеки деконволюируются, и синапсы либо подсчитываются вручную с помощью ImageJ, либо более обширная количественная оценка синаптических структур осуществляется с помощью процедур анализа изображений, специально написанных в Matlab.
Introduction
Возрастная потеря слуха является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире, которое поражает более трети населения мира в возрасте 65 лет и старше1 года. Основные причины все еще обсуждаются и активно исследуются, но могут включать потерю специализированных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки (IHC) с афферентными слуховыми нервными волокнами2. Эти ленточные синапсы содержат пресинаптическую структуру, которая имеет везикулы, заполненные привязанным к нему нейромедиатором глутаматом, а также постсинаптические α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) глутаматных рецепторов 3,4,5. У песчанки ~20 афферентных слуховых нервных волокон контактируют с одним IHC 6,7,8. Волокна на IHC, обращенные к модиолу, противостоят большим синаптическим лентам, в то время как волокна, соединяющиеся на стороне столба IHC, сталкиваются с небольшими синаптическими лентами (т. Е. У кошек9, песчанок7, морских свинок10 и мышей 3,11,12,13,14). Кроме того, у песчанки размер пресинаптических лент и постсинаптических глутаматных пятен положительно коррелирует 7,14. Волокна, которые противостоят большим лентам на модиолярной стороне IHC, имеют малый калибр и имеют низкие спонтанные показатели и высокие пороги15. Имеются данные о том, что волокна с низкой спонтанной скоростью более уязвимы к воздействию шума10 и ототоксических препаратов16, чем высокоспонтанные низкопороговые волокна, которые расположены на стороне столба IHC15.
Потеря ленточных синапсов является самым ранним дегенеративным событием при кохлеарной нервной возрастной тугоухости, в то время как потеря спиральных ганглиозных клеток и их афферентных слуховых нервных волокон отстает от17,18. Электрофизиологические корреляты включают записи слуховых реакций ствола мозга17 и потенциалов действия соединения8; однако они не отражают тонкостей потери синапсов, поскольку низкая спонтанная скорость волокон не способствует этим показателям16. Более перспективными электрофизиологическими метриками являются нейронный индекс19, полученный из потенциала массы, и перистимулированный временной ответ20. Однако они надежны только в том случае, если у животного нет других кохлеарных патологий, кроме потери слуховых нервных волокон, которые влияют на активность оставшихся слуховых нервных волокон8. Кроме того, поведенчески оцененные пороги у песчанки не коррелировали с синапсовыми числами21. Поэтому достоверная количественная оценка сохранившихся ленточных синапсов и, таким образом, количества функциональных слуховых нервных волокон возможна только при непосредственном исследовании кохлеарной ткани.
Монгольская песчанка (Meriones unguiculatus) является подходящей животной моделью для изучения возрастной потери слуха. Он имеет короткую продолжительность жизни, имеет низкочастотный слух, похожий на человеческий, прост в обслуживании и показывает сходство с патологиями человека, связанными с возрастной потерей слуха 2,22,23,24. Песчанки считаются пожилыми, когда они достигают 36-месячного возраста, что ближе к концу их средней продолжительности жизни22. Важно отметить, что возрастная потеря ленточных синапсов была продемонстрирована у песчанок, выросших и выдержанных в спокойной обстановке 8,21.
Здесь представлен протокол иммуномаркировки, вскрытия и анализа улиток у песчанок разного возраста, от молодых людей до пожилых людей. Используются антитела, направленные против компонентов пресинапса (CtBP2), постсинаптических пластырей рецепторов глутамата (GluA2) и IHC (myoVIIa). Применяется автофлуоресцентный гаситель, который уменьшает фон в состаренных улитках и оставляет флуоресцентный сигнал нетронутым. Далее дается описание того, как рассечь улитку для изучения как сенсорного эпителия, так и сосудистой полосы. Длина кохлеарности измеряется для того, чтобы можно было выбрать различные кохлеарные места, соответствующие конкретным наилучшим частотам25. Количественная оценка чисел синапсов осуществляется с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ26. Дополнительная количественная оценка объемов и местоположений синапсов в пределах отдельного HC выполняется с помощью программного обеспечения, написанного на Matlab. Это программное обеспечение не является общедоступным, так как авторам не хватает ресурсов для предоставления профессиональной документации и поддержки.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью метода, описанного в этом протоколе, можно иммуномаркировать IHC и синаптические структуры в улитках молодых взрослых и пожилых песчанок, идентифицировать предполагаемые функциональные синапсы путем совместной локализации пре- и постсинаптических элементов, распределить их…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Личун Чжану за помощь в создании метода и Службы флуоресцентной микроскопии Университета Карла фон Осецкого в Ольденбурге за использование средств визуализации. Это исследование финансировалось Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии – EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
