젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스
Summary
구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
내부 모발 세포와 구심성 청각 신경 섬유를 연결하는 리본 시냅스의 손실은 연령 관련 청력 손실의 한 원인으로 간주됩니다. 리본 시냅스의 손실을 검출하는 가장 일반적인 방법은 개별 달팽이관의 여러 토노토픽 위치에서 정량적 샘플링을 허용하기 때문에 면역 표지입니다. 그러나 관심있는 구조는 뼈 달팽이관 깊숙이 묻혀 있습니다. Gerbils는 연령 관련 청력 손실에 대한 동물 모델로 사용됩니다. 여기에서는 고정, 게르빌 달팽이관 전체 마운트, 공초점 이미징 및 리본 시냅스 수 및 부피 정량화를 위한 일상적인 프로토콜이 설명된다. 또한, 귀중한 노화 된 개인으로부터 좋은 재료를 얻는 것과 관련된 특별한 도전이 강조됩니다.
Gerbils는 안락사되어 심혈관적으로 관류되거나 고막 bullae가 두개골에서 조심스럽게 해부됩니다. 달팽이관은 정점과 기저부에서 열리고 고정제로 직접 옮겨집니다. 초기 방법에 관계없이, 달팽이관은 후고정되고 이후에 탈석회화됩니다. 그런 다음 조직은 시냅스 전후 구조 및 모발 세포에 대한 일차 항체로 표지됩니다. 다음에, 달팽이관은 그들의 각각의 일차 것들에 특이적인 이차 형광 태깅된 항체와 함께 인큐베이션된다. 노화 된 gerbils의 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되어 오래된 동물 조직의 전형적으로 실질적인 배경 형광을 줄입니다.
마지막으로, 달팽이관은 6-11 개의 세그먼트로 해부됩니다. 전체 달팽이관 길이는 특정 달팽이관 위치가 개인간에 안정적으로 결정될 수 있도록 재구성됩니다. 순차적으로 획득된 공초점 이미지 스택은 선택한 위치에서 모발 세포와 시냅스를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 공초점 스택은 디컨볼루브되고 시냅스는 ImageJ를 사용하여 수동으로 계산되거나 Matlab에서 사용자 정의 작성된 이미지 분석 절차를 사용하여 시냅스 구조의보다 광범위한 정량화가 수행됩니다.
Introduction
연령 관련 난청은 65세 이상 1세 이상 세계 인구의 3분의1 이상에 영향을 미치는 세계에서 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 근본적인 원인은 여전히 논쟁 중이며 적극적으로 조사되고 있지만 구심성 청각 신경 섬유2와 내부 모발 세포 (IHC)를 연결하는 특수 시냅스의 손실을 포함 할 수 있습니다. 이러한 리본 시냅스는 신경 전달 물질 글루타메이트로 채워진 소포뿐만 아니라 시냅스 후 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 글루타메이트 수용체 3,4,5로 채워진 소포를 갖는 시냅스 전 구조를 포함한다. 게르빌에서, ~20개의 구심성 청각 신경 섬유가 하나의 IHC 6,7,8에 접촉한다. 모디올러스를 향하는 IHC 상의 섬유는 큰 시냅스 리본과 반대되는 반면, IHC의 기둥 측에 연결되는 섬유는 작은 시냅스 리본(즉, 고양이9, 게르빌7, 기니피그 10, 및 마우스 3,11,12,13,14)을 직면한다. 또한, 게르빌에서는 시냅스 전 리본과 시냅스 후 글루타메이트 패치의 크기가 7,14와 양의 상관 관계가 있습니다. IHC의 모디올라 쪽에 있는 큰 리본에 반대되는 섬유는 구경이 작고 낮은 자발적 속도와 높은 임계값(15)을 갖는다. 낮은 자발적 속도 섬유가 IHCs(15)의 기둥 측에 위치하는 높은 자발적 저역치 섬유보다 소음 노출(10) 및 이독성 약물(16)에 더 취약하다는 증거가 있다.
리본 시냅스의 손실은 달팽이관 신경 연령 관련 청력 손실에서 가장 초기의 퇴행성 사건이며, 나선형 신경절 세포와 구심성 청각 신경 섬유의 손실은17,18보다 뒤쳐집니다. 전기생리학적 상관관계는 청각 뇌간 반응(17) 및 복합 작용 전위(8)의 기록을 포함한다; 그러나, 이들은 시냅스 손실의 미묘함을 반영하지 않는데, 이는 낮은 자발적 속도 섬유가 이들 측정(16)에 기여하지 않기 때문이다. 더 유망한 전기생리학적 메트릭들은 질량 전위-유도 신경 지수(19) 및 주변 자극 시간 응답(20)이다. 그러나, 이들은 동물이 청각 신경 섬유 손실을 넘어 나머지 청각 신경 섬유의 활성에 영향을 미치는 다른 달팽이관 병리가없는 경우에만 신뢰할 수 있습니다8. 또한, 게르빌에서 행동적으로 평가된 역치는 시냅스 번호21과 상관관계가 없었다. 따라서, 생존하는 리본 시냅스의 신뢰할 수 있는 정량화, 따라서, 기능적 청각 신경 섬유의 수는 달팽이관 조직의 직접적인 검사에 의해서만 가능하다.
몽골 게르빌 (Meriones unguiculatus)은 연령과 관련된 청력 손실을 연구하기에 적합한 동물 모델입니다. 수명이 짧고 인간과 비슷한 저주파 청력을 가지며 유지가 쉽고 연령 관련 청력 손실과 관련된 인간 병리와 유사성을 보여줍니다 2,22,23,24. Gerbils는 평균 수명22의 끝 부분에 가까운 36 개월에 도달하면 노화 된 것으로 간주됩니다. 중요하게도, 리본 시냅스의 연령과 관련된 손실은 조용한 환경에서 양육되고 노화 된 게르빌에서 입증되었습니다 8,21.
여기에서는 젊은 성인에서 노인에 이르기까지 다양한 연령대의 게르빌에서 달팽이관을 면역표지, 해부 및 분석하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 시냅스 전 (CtBP2), 시냅스 후 글루타메이트 수용체 패치 (GluA2) 및 IHC (myoVIIa)의 성분에 대해 지시된 항체가 사용된다. 노화된 달팽이관의 배경을 감소시키고 형광 신호를 그대로 유지하는 자가형광 소광기가 적용됩니다. 또한, 달팽이관을 해부하여 감각 상피와 선조 혈관을 모두 검사하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 달팽이관 길이는 특정 최적 주파수(25)에 대응하는 별개의 달팽이관 위치들의 선택을 가능하게 하기 위해 측정된다. 시냅스 수의 정량화는 자유롭게 이용가능한 소프트웨어 ImageJ26으로 수행된다. 개별 HC 내의 시냅스 부피 및 위치의 추가적인 정량화는 Matlab으로 작성된 소프트웨어 커스텀으로 수행됩니다. 이 소프트웨어는 저자가 전문적인 문서 및 지원을 제공 할 수있는 리소스가 부족하기 때문에 공개적으로 사용할 수 없습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 설명 된 방법을 사용하면 젊은 성인 및 노인 게르빌의 달팽이관에서 IHC 및 시냅스 구조를 면역표지하고, 시냅스 전후 및 사후 시냅스 요소의 공동 국소화를 통해 추정 된 기능적 시냅스를 확인하고, 개별 IHC에 할당하고, 수, 부피 및 위치를 정량화 할 수 있습니다. 이 접근법에 사용된 항체는 또한 외부 모발 세포 (OHCs; myoVIIa) 및 그들의 시냅스 전 리본을 표지하였다. 또한, IHC와 OHC ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Lichun Zhang이 이미징 시설의 사용을 위해 Oldenburg의 Carl von Ossietzky University of Oldenburg의 Fluorescent Microscopy Service Unit과 방법을 수립하는 데 도움을 준 것을 인정합니다. 이 연구는 독일의 우수성 전략 -EXC 2177/1에 따라 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
