Immunmärkning och räkning av bandsynapser hos unga vuxna och äldre Gerbil Cochleae
Summary
Ett protokoll för bearbetning av unga vuxna och äldre gerbil cochleae genom att immunmärka de afferenta synaptiska strukturerna och hårcellerna, släcka autofluorescens i åldrig vävnad, dissekera och uppskatta längden på cochleae och kvantifiera synapserna i bildstaplar erhållna med konfokal avbildning presenteras.
Abstract
Förlusten av bandsynapser som förbinder inre hårceller och afferenta hörselnervfibrer antas vara en orsak till åldersrelaterad hörselnedsättning. Den vanligaste metoden för att detektera förlusten av bandsynapser är immunmärkning eftersom det möjliggör kvantitativ provtagning från flera tonotopiska platser i en enskild cochlea. Strukturerna av intresse är dock begravda djupt inne i den beniga cochlea. Gerbils används som en djurmodell för åldersrelaterad hörselnedsättning. Här beskrivs rutinprotokoll för fixering, immunmärkning av gerbil cochleära helfästen, konfokal avbildning och kvantifiering av bandsynapsnummer och volymer. Vidare lyfts de särskilda utmaningar som är förknippade med att få bra material från värdefulla åldrande individer fram.
Gerbiler avlivas och antingen perfuseras kardiovaskulärt, eller så dissekeras deras tympaniska bullae noggrant ut ur skallen. Cochleae öppnas vid toppen och basen och överförs direkt till fixativet. Oavsett den ursprungliga metoden postfixeras cochleae och avkalkas därefter. Vävnaden märks sedan med primära antikroppar mot pre- och postsynaptiska strukturer och hårceller. Därefter inkuberas cochleae med sekundära fluorescensmärkta antikroppar som är specifika mot deras respektive primära. Cochleae hos åldrade gerbiler behandlas sedan med en autofluorescenssläckare för att minska den typiskt betydande bakgrundsfluorescensen hos äldre djurs vävnader.
Slutligen dissekeras cochleae i 6-11 segment. Hela cochleärlängden rekonstrueras så att specifika cochleära platser kan bestämmas på ett tillförlitligt sätt mellan individer. Konfokala bildstaplar, förvärvade sekventiellt, hjälper till att visualisera hårceller och synapser på de valda platserna. De konfokala stackarna är dekonvolverade, och synapserna räknas antingen manuellt med hjälp av ImageJ, eller så utförs mer omfattande kvantifiering av synaptiska strukturer med bildanalysprocedurer specialskrivna i Matlab.
Introduction
Åldersrelaterad hörselnedsättning är en av världens vanligaste sjukdomar som drabbar mer än en tredjedel av världens befolkning i åldern 65 år och äldre1. De bakomliggande orsakerna diskuteras fortfarande och undersöks aktivt men kan inkludera förlusten av de specialiserade synapserna som förbinder inre hårceller (IHC) med afferenta hörselnervfibrer2. Dessa bandsynapser består av en presynaptisk struktur som har vesiklar fyllda med neurotransmittorn glutamat bunden till den, liksom postsynaptisk α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kommer ~20 afferenta hörselnervfibrer i kontakt med en IHC 6,7,8. Fibrer på IHC som vetter mot modiolus står emot stora synaptiska band, medan fibrerna som förbinder på pelarsidan av IHC möter små synaptiska band (dvs. hos katter9, gerbiler7, marsvin10 och möss 3,11,12,13,14). Vidare, i gerbilen, är storleken på de presynaptiska banden och de postsynaptiska glutamatplåsterna positivt korrelerade 7,14. Fibrer som står emot stora band på den modiolära sidan av IHC är små i kaliber och har låga spontana hastigheter och höga trösklar15. Det finns bevis för att fibrer med låg spontan hastighet är mer sårbara för bullerexponering10 och ototoxiska läkemedel16 än fibrer med hög spontan låg tröskel, som ligger på pelarsidan av IHC15.
Förlusten av bandsynapser är den tidigaste degenerativa händelsen vid cochleär neural åldersrelaterad hörselnedsättning, medan förlusten av spiral ganglionceller och deras afferenta hörselnervfibrer ligger efter17,18. Elektrofysiologiska korrelat inkluderar inspelningar av auditiva hjärnstamssvar17 och sammansatta åtgärdspotentialer8; dessa återspeglar emellertid inte subtiliteterna av synapsförlust, eftersom fibrer med låg spontan hastighet inte bidrar till dessa åtgärder16. Mer lovande elektrofysiologiska mätvärden är masspotential-härledd neuralt index19 och peristimulus tidsrespons20. Dessa är emellertid endast tillförlitliga om djuret inte har några andra cochleära patologier, utöver hörselnervfiberförlust, som påverkar aktiviteten hos de återstående hörselnervfibrerna8. Dessutom var beteendebedömda trösklar i gerbilen inte korrelerade med synapsnummer21. Därför är tillförlitlig kvantifiering av överlevande bandsynapser och därmed antalet funktionella hörselnervfibrer endast möjlig genom direkt undersökning av cochleärvävnaden.
Den mongoliska gerbilen (Meriones unguiculatus) är en lämplig djurmodell för att studera åldersrelaterad hörselnedsättning. Den har en kort livslängd, har lågfrekvent hörsel som liknar människor, är lätt att underhålla och visar likheter med mänskliga patologier relaterade till åldersrelaterad hörselnedsättning 2,22,23,24. Gerbils anses vara åldrade när de når 36 månaders ålder, vilket är nära slutet av deras genomsnittliga livslängd22. Viktigt är att en åldersrelaterad förlust av bandsynapser har visats i gerbiler upphöjda och åldrade i tysta miljöer 8,21.
Här presenteras ett protokoll för att immunmärka, dissekera och analysera cochleae från gerbiler i olika åldrar, från unga vuxna till äldre. Antikroppar riktade mot komponenter i presynapsen (CtBP2), postsynaptiska glutamatreceptorplåster (GluA2) och IHC (myoVIIa) används. En autofluorescenssläckare appliceras som minskar bakgrunden i åldriga cochleae och lämnar fluorescenssignalen intakt. Vidare ges en beskrivning av hur man dissekerar snäckan för att undersöka både det sensoriska epitelet och stria vascularis. Cochleärlängden mäts för att möjliggöra val av distinkta cochleära platser som motsvarar specifika bästa frekvenser25. Kvantifiering av synapsnummer utförs med den fritt tillgängliga programvaran ImageJ26. Ytterligare kvantifiering av synapsvolymer och platser inom den enskilda HC utförs med programvara anpassad i Matlab. Denna programvara görs inte offentligt tillgänglig, eftersom författarna saknar resurser för att tillhandahålla professionell dokumentation och support.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den metod som beskrivs i detta protokoll är det möjligt att immunmärka IHC och synaptiska strukturer i cochleae från unga vuxna och äldre gerbiler, identifiera förmodade funktionella synapser genom samlokalisering av pre- och postsynaptiska element, fördela dem till enskilda IHC och kvantifiera deras antal, volym och plats. Antikropparna som användes i detta tillvägagångssätt märkte också yttre hårceller (OHC; myoVIIa) och deras presynaptiska band. Dessutom är ett livskraftigt alternativ för immunmä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Lichun Zhang för att ha hjälpt till att etablera metoden och Fluorescensmikroskopi serviceenheten, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, för användning av bildbehandlingsanläggningarna. Denna forskning finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) under Tysklands Excellensstrategi -EXC 2177/1.
Materials
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker – Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H. Presbycusis. The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -. S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O’Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
