वर्तमान प्रोटोकॉल मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला जैसी कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) का वर्णन करता है। इन कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति में आत्म-नवीनीकरण क्षेत्रों के रूप में सुसंस्कृत किया जा सकता है या वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
फेफड़ों में, वायुकोशीय उपकला पर्यावरणीय उत्तेजनाओं से एक शारीरिक बाधा है और होमियोस्टेसिस और बीमारी में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। टाइप 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं (एटी 2 एस) डिस्टल फेफड़ों के उपकला के संकाय पूर्वज हैं। एटी 2 की शिथिलता और चोट के परिणामस्वरूप और विभिन्न फेफड़ों की बीमारियों में योगदान हो सकता है। एटी 2 जीव विज्ञान की बेहतर समझ, इस प्रकार, फेफड़ों के जीव विज्ञान और बीमारी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, प्राथमिक मानव एटी 2 आम तौर पर अलग करना मुश्किल होता है और आपूर्ति में सीमित होता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) को एक निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है जो विवो फेफड़ों के विकास में पुनरावृत्ति करता है। आईएटी 2 फीडर-मुक्त स्थितियों में बढ़ते हैं, मानव वयस्क प्राथमिक एटी 2 के साथ एक ट्रांसक्रिप्टोमिक कार्यक्रम साझा करते हैं, और उत्पादन, पैकेजिंग और सर्फैक्टेंट के स्राव जैसे एटी 2 के प्रमुख कार्यों को निष्पादित करते हैं। यह प्रोटोकॉल तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में सीरियल पासिंग के माध्यम से आत्म-नवीनीकरण आईएटी 2 को बनाए रखने या एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति के लिए आईएटी 2 को अनुकूलित करने के तरीकों का विवरण देता है। आईएटी 2 एस का एक एकल-सेल निलंबन 3 डी घुलनशील तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (इसके बाद “मैट्रिक्स” के रूप में संदर्भित) में चढ़ाना से पहले उत्पन्न होता है, जहां वे मोनोलेयर्ड उपकला क्षेत्रों में स्वयं इकट्ठा होते हैं। 3 डी संस्कृति में आईएटी 2 को 2 डी एएलआई संस्कृति में पारित या चढ़ाया जाने के लिए एकल-सेल निलंबन में क्रमिक रूप से अलग किया जा सकता है। अली संस्कृति में, आईएटी 2 एस हवा के संपर्क में आने वाली एपिकल सतह के साथ एक ध्रुवीकृत मोनोलेयर बनाते हैं, जिससे यह मंच पर्यावरणीय एक्सपोजर के लिए आसानी से उत्तरदायी हो जाता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल आईएटी 2 एस की एक अटूट आपूर्ति उत्पन्न करता है, जो एसएफटीपीसीटीडीटोमैटो अभिव्यक्ति द्वारा इंगित एटी 2 कार्यक्रम को बनाए रखते हुए 15 मार्गों पर प्रति इनपुट सेल प्रति 1 एक्स10 30 कोशिकाओं के ऊपर का उत्पादन करता है। परिणामी कोशिकाएं एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रासंगिक मंच का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसे आनुवंशिक उत्परिवर्तन, मॉडल पर्यावरणीय एक्सपोजर या स्क्रीन दवाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
फेफड़ों में, वायुमार्ग और वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं साँस के पर्यावरणीय जोखिमों का सामना करने वाले पहले व्यक्ति होते हैं, जिसमें साँस एरोसोल और सिगरेट के धुएं जैसे हानिकारक उत्तेजनाओं के माध्यम से प्रेषित रोगजनकशामिल हैं। टाइप 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाएं (एटी 2 एस) फेफड़ों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में आवश्यक हैं क्योंकि वे डिस्टल फेफड़ों के उपकला के संकाय पूर्वज हैं, वायुकोशीय सतह तनाव को दूर करने के लिए सर्फैक्टेंट्स का उत्पादन करते हैं, और साँसएक्सपोजर 1,2 के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को माउंट करते हैं। हालांकि, एटी 2 डिसफंक्शन फेफड़ों की चोटों या जीनों में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप हो सकता है जो चुनिंदा रूप से एटी 2 में व्यक्त किए जाते हैं, जैसे कि एसएफटीपीसी, एसएफटीपीबी, और एबीसीए 3 3,4,5। इन आनुवांशिक उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए पिछले दृष्टिकोणों ने माउस मॉडल6 या इंजीनियर, उत्परिवर्तन युक्त वैक्टर पर भरोसा किया है जो अमर सेल लाइनों7 में पेश किए गए हैं। इसलिए, प्लेटफ़ॉर्म जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकारों में और इन विट्रो सिस्टम में उत्पादक में एटी 2 पर आनुवंशिक और पर्यावरणीय गड़बड़ी के प्रभावों को मॉडल कर सकते हैं, स्वास्थ्य और बीमारी में एटी 2 की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक हैं।
एयरबोर्न एक्सपोजर मॉडलिंग के संदर्भ में, प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों का सफलतापूर्वक उपयोग सिगरेट के धुएं8 के लिए प्रमुख आणविक प्रतिक्रियाओं को प्रकट करने और वायुमार्ग संक्रमण 9,10 मॉडल करने के लिए किया गया है। वायुकोशीय उपकला के लिए एक तुलनीय अली संस्कृति प्रणाली, बीमारी में संक्रमण या चोट की एक प्रमुख साइट, वायुमार्ग उपकला मॉडल प्रणाली की तुलना में बहुत कम विकसित है। वायुकोशीय उपकला11,12 के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में एएलआई में अमर सेल लाइनों को सुसंस्कृत किया गया है, लेकिन ये सेल लाइनें प्राथमिक वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं13 से ट्रांसक्रिप्टोमिक रूप से अलग हैं और प्रमुख सेलुलर मशीनरी की कमी है, जैसे कि सर्फैक्टेंट्स को स्रावित करने या एएलआई12 में तंग जंक्शन बनाने की क्षमता। प्राथमिक मानव एटी 2 को फाइब्रोब्लास्ट1,14 की उपस्थिति में 3 डी क्षेत्रों में सुसंस्कृत किया जा सकता है, लेकिन सीमाओं के अधीन हैं, जिसमें एक्सप्लैंट फेफड़ों से सीमित पहुंच और आज तक अधिकांश संस्कृतियों में सेलुलर फेनोटाइप को सेनेस या खोने की उनकी प्रवृत्ति शामिल है। ये विशेषताएं इन विट्रो अध्ययनों में प्राथमिक एटी 2 के व्यापक गोद लेने के लिए बाधाएं प्रस्तुत करती हैं, हालांकि प्राथमिक एटी 2 एस 15,16,17,18 के विस्तार के लिए फीडर-मुक्त 3 डी संस्कृतियों को अनुकूलित करने में हाल ही में प्रगति की गई है।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न प्रकार 2 वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (आईएटी 2 एस) 19 उत्पन्न करने के लिए विवो विकास ता्मक मील के पत्थर में पुनरावृत्ति के लिए निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। आईएटी 2 एस 3 डी सीरम-मुक्त संस्कृति में एक परिभाषित माध्यम में आत्म-नवीनीकरण क्षेत्रों के रूप में बढ़ते हैं जिसमें चीर 99 021, केजीएफ, डेक्सामेथासोन, सीएएमपी, और 3-आइसोब्यूटिल -1-मिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) शामिल हैं, जिसे फाइब्रोब्लास्ट फीडर की अनुपस्थिति में “सीके + डीसीआई” 19 कहा जाता है और >20 मार्ग20,21 के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। इसके अलावा, आईएटी 2 मानव वयस्क प्राथमिक एटी 2 एस के साथ एक ट्रांसक्रिप्टोमिक कार्यक्रम साझा करते हैं, लैमेलर निकाय बनाते हैं, और सर्फैक्टेंट19,21,22 का उत्पादन और पैकेज करते हैं। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं को एकल-सेल निलंबन से अलग करके आईएटी 2 एस के सीरियल पासिंग का विवरण देता है। इस बिंदु पर, आईएटी 2 एस को 3 डी संस्कृति में आगे बढ़ाया और विस्तारित किया जा सकता है या 2 डी अली संस्कृति23 में चढ़ाया जा सकता है। इन विधियों का उपयोग होमियोस्टेसिस और बीमारी20,22 में एटी 2 एस के आंतरिक जीव विज्ञान का अध्ययन करने और एक स्केलेबल, शारीरिक रूप से प्रासंगिक मंच23,24 में यौगिकों या उत्तेजनाओं के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले दिखाया गया है।
एटी 2 फेफड़ों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है, और इन प्रमुख वायुकोशीय कोशिकाओं की शिथिलता विभिन्न फेफड़ों की बीमारियों का कारण और परिणाम दोनों कर सकती है। प्राथमिक मानव एटी 2 एस तक पहुंचने और अलग करने की कठिनाई के कारण, आईएटी 2 उत्पन्न होते हैं। कहीं औरवर्णित निर्देशित भेदभाव विधियों और यहां वर्णित विस्तार और सेल सीडिंग को लागू करके, किसी भी व्यक्ति से उत्पन्न आईपीएससी को मजबूत रूप से स्व-नवीनीकरण आईएटी 2 एस में विभेदित किया जा सकता है, इस प्रकार बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए रोगी-विशिष्ट कोशिकाएं प्रदान की जा सकती हैं, जिसमें बुनियादी बायोमेडिकल अनुसंधान विकास अध्ययन, रोग मॉडलिंग, सेल-आधारित उपचार, या दवा स्क्रीन शामिल हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में आईएटी 2 को एकल-सेल निलंबन से अलग करने के लिए एक विधि का विवरण दिया गया है, जिसे तब सेल विस्तार के लिए एल्वियोलोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए 3 डी मैट्रिगेल में फिर से तैयार किया जा सकता है या आगे के प्रयोगों के लिए 2 डी एएलआई संस्कृति में फिर से तैयार किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल में 3 डी और एएलआई संस्कृतियों दोनों में सफल पासिंग और रिप्लेटिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। मैकेनिकल ट्रिटरेशन को कम से कम किया जाना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक पाइपिंग सेल व्यवहार्यता को कम कर सकती है। इसके अलावा, 3 डी और 2 डी एएलआई संस्कृतियों दोनों में आईएटी 2 एस का सीडिंग घनत्व महत्वपूर्ण है; 3 डी संस्कृति के लिए, सामान्य तौर पर, 3 डी मैट्रिगेल के 400 कोशिकाओं / हालांकि, 100-500 कोशिकाओं / μL से घनत्व की एक श्रृंखला, कभी-कभी, सफल रही है, और घनत्व को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों के लिए आवश्यक हो सकता है। अली संस्कृति के लिए, सेल संस्कृति आवेषण पर आईएटी 2 एस के सीडिंग घनत्व को अनुकूलित करना भी सीडिंग के 48 घंटे बाद कोशिकाओं के एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है (यानी, एयर-लिफ्ट के दिन)। कुछ आईएटी 2 लाइनों को प्रति डालने के लिए अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; इस प्रकार, यदि समस्या निवारण की आवश्यकता होती है, तो 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण के लिए 160,000-300,000 कोशिकाओं / 3 डी संस्कृतियों को 3 डी मैट्रिक्स के 400 कोशिकाओं / μL पर बोने घनत्व को बनाए रखने और मैट्रिक्स बूंद आकार को क्रमशः 25 μL और 20 μL तक कम करके 24- और 48-अच्छी तरह से प्लेटों तक बढ़ाया जा सकता है। अली संस्कृतियों को मैट्रिक्स के 30 μL के साथ प्रत्येक डालने कोटिंग करके 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति आवेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है, प्रति सम्मिलित 30 μL में 80,000 कोशिकाओं चढ़ाना, और प्रति अच्छी तरह से बेसोलेटरल मीडिया के 150 μL के साथ खिलाना। सीडिंग घनत्व और मैट्रिक्स और मीडिया वॉल्यूम को अन्य प्लेट प्रारूपों के लिए तदनुसार स्केल और अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि अली चढ़ाना के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को आईएटी 2 एएलआई बनाने के लिए एनकेएक्स 2-1 + और एसएफटीपीसी + 19,20,21,23 होने के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध किया जाना चाहिए, और एएलआई संस्कृति गठन लाइन से लाइन तक भिन्न हो सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एटी 2-केवल संस्कृतियों के विस्तार और पीढ़ी की अनुमति देता है, जो एक प्रमुख वायुकोशीय सेल प्रकार के आधार पर एक न्यूनीकरणवादी मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि अन्य प्रासंगिक वायुकोशीय सेल प्रकार, जैसे वायुकोशीय प्रकार 1 कोशिकाएं, इन प्लेटफार्मों से गायब थीं। अन्य समूहों को फाइब्रोब्लास्ट 1,14,15,16,17 के साथ या उसके बिना स्फेरॉइड या ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों के रूप में प्राथमिक मानव एटी 2 एस को संवर्धन करने में सफलता मिली है; हालांकि, प्राथमिक मानव एटी 2 एस एएलआई स्थितियों26 के बिना सामान्य 2 डी संस्कृति में सुसंस्कृत होने पर प्रमुख सर्फैक्टेंट्स की अपनी अभिव्यक्ति खो देते हैं। इसके अलावा, हाल के काम से पता चला है कि आईएटी 2 एस ताजा, असभ्य मानव प्राथमिक एटी 2 एस27 की तुलना में उच्च प्रोलिफेरेटिव मार्कर और कम एटी 2 परिपक्वता मार्करों को व्यक्त करते हैं। आईएटी 2 एस और ताजा प्राथमिक मानव एटी 2 एस के बीच इन मतभेदों के बावजूद, हमने पाया कि यहां तक कि सुसंस्कृत प्राथमिक एटी 2 ने ताजा, असभ्य प्राथमिक एटी 2एस 27 से ट्रांसक्रिप्टोमिक मतभेद प्रदर्शित किए, और इस प्रकार निष्कर्ष निकाला कि इन इन विट्रो मॉडलों में विवो फेफड़ों के जीव विज्ञान में मॉडलिंग के लिए विभिन्न ताकत और सीमाएं हैं।
आईएटी 2 प्लेटफ़ॉर्म को रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी 19,20 से आनुवंशिक उत्परिवर्तनका अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग को समायोजित करने के लिए सिस्टम को काफी हद तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, आईएटी 2 एएलआई पर्यावरणीय एक्सपोजर जैसे वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण या सिगरेट के धुएं, ई-सिगरेट वाष्प, या अन्य एरोसोल23 के संपर्क में आने के लिए उपयुक्त हैं। संक्षेप में, आईएटी 2 एस के 3 डी और 2 डी अली संस्कृतियों दोनों को उत्पन्न करने के लिए यह प्रोटोकॉल एक रोग-प्रासंगिक सेल प्रकार की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अनुमति देता है और एक शारीरिक, स्केलेबल मंच प्रदान करता है जो कई अनुप्रयोगों में इन कोशिकाओं के उपयोग को सक्षम बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
हम ईमानदारी से विल्सन, कोटन और हॉकिन्स प्रयोगशालाओं के सदस्यों को उनकी सहायक चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ग्रेग मिलर (सीआरईएम प्रयोगशाला प्रबंधक) और मैरिएन जेम्स (आईपीएससी कोर मैनेजर) के अमूल्य समर्थन के लिए भी बहुत आभारी हैं। हम सेल सॉर्टिंग (एनआईएच अनुदान #1S10OD021587 -01 ए 1 द्वारा समर्थित) के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए ब्रायन टिल्टन और बीयूएमसी फ्लो साइटोमेट्री कोर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से सीजे मार्टिन अर्ली करियर फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था जो आरबीडब्ल्यू को सम्मानित किया गया था; एनआईएच केएमए को एफ 30 एचएल 147426 अनुदान देता है; द पल्मोनरी फाइब्रोसिस फाउंडेशन से आईएम रोसेनज़वेग जूनियर इन्वेस्टिगेटर अवार्ड और केडीए को बोस्टन यूनिवर्सिटी क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट (1यूएल 1 टीआर 001430) के माध्यम से एक एकीकृत पायलट अनुदान पुरस्कार; एबीए के लिए स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (P2ELP3_191217); एनआईएच डीएनके को यू01एचएल 148692, यू01एचएल 134745, यू01एचएल 134766 और आर 01एचएल 0 9 5 99 3 प्रदान करता है; और एनआईएच अनुदान यू01टीआर001810, आर 01 डीके 101510, और आर 01 डीके 117940 एएडब्ल्यू को सम्मानित किया गया; आईपीएससी रखरखाव, बैंकिंग और साझाकरण एनआईएच अनुदान संख्या 1 75 एन 9 2020 सी 00005 द्वारा समर्थित हैं। चित्रा 1 Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) – Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) – Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts – Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |