Summary
本方案描述了人诱导的多能干细胞衍生的2型肺泡上皮样细胞(iAT2s)。这些细胞可以在3D培养物中作为自我更新球体培养或适应气液界面(ALI)培养。
Abstract
在肺部,肺泡上皮是环境刺激的物理屏障,在体内平衡和疾病中起着至关重要的作用。2 型肺泡上皮细胞 (AT2s) 是远端肺上皮的兼性祖细胞。AT2s的功能障碍和损伤可由各种肺部疾病引起并导致其发展。因此,提高对AT2生物学的理解对于理解肺部生物学和疾病至关重要;然而,原代人用AT2通常难以分离,供应有限。为了克服这些局限性,人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的2型肺泡上皮细胞(iAT2s)可以通过定向分化方案产生,该方案概括 体内 肺发育。iAT2s在无饲养层条件下生长,与人类成年初级AT2共享转录组学程序,并执行AT2s的关键功能,如表面活性剂的生产,包装和分泌。该协议详细介绍了通过在三维(3D)培养物中进行串行传代或使iAT2适应气液界面(ALI)培养来维持自我更新的iAT2的方法。在3D增溶基底膜基质(以下简称“基质”)中电镀之前,产生iAT2的单细胞悬浮液,在那里它们自组装成单层上皮球。3D培养物中的iAT2可以连续解离成单细胞悬浮液,以便在2D ALI培养物中传代或接种。在ALI培养物中,iAT2s形成极化的单层,顶端表面暴露在空气中,使该平台易于适应环境暴露。因此,该协议产生取之不尽的iAT2供应,在15个传代中每个输入细胞产生超过1 x10 30 个细胞,同时保持SFTPCtdTomato 表达指示的AT2程序。由此产生的细胞代表了一个可重复且相关的平台,可用于研究基因突变,模拟环境暴露或筛选药物。
Introduction
在肺部,气道和肺泡上皮细胞首先遇到吸入环境暴露,包括通过吸入气溶胶和香烟烟雾等有毒刺激传播的病原体。2 型肺泡上皮细胞 (AT2s) 对于维持肺稳态至关重要,因为它们是远端肺上皮的兼性祖细胞,产生表面活性剂以缓解肺泡表面张力,并对吸入暴露产生先天免疫反应1,2。然而,AT2 功能障碍可由肺损伤或选择性在 AT2 中表达的基因突变引起,例如 SFTPC、SFTPB 和 ABCA3 3,4,5。以前研究这些基因突变的方法依赖于小鼠模型6或引入永生化细胞系7的工程,含有突变的载体。因此,需要能够模拟遗传和环境扰动对生理相关细胞类型和生产性体外系统中AT2s的影响的平台,以进一步了解AT2在健康和疾病中的作用。
在模拟空气传播暴露方面,原代气道上皮细胞的气液界面(ALI)培养物已成功用于揭示对香烟烟雾的关键分子反应8和模拟气道感染9,10。与气道上皮模型系统相比,肺泡上皮(疾病中感染或损伤的关键部位)的类似ALI培养系统发展得更少。永生化细胞系已在ALI中培养为肺泡上皮11,12的代理,但这些细胞系在转录学上与原代肺泡上皮细胞13不同,并且缺乏关键的细胞机制,例如在ALI12处分泌表面活性剂或形成紧密连接的能力。原代人类AT2可以在成纤维细胞1,14存在的情况下在3D球体中培养,但受到限制,包括外植体肺的可及性有限以及它们在迄今为止大多数培养物中衰老或失去细胞表型的倾向。这些特征阻碍了原代AT2体外研究的广泛采用,尽管最近在优化无饲养层3D培养以扩增原代AT2s15,16,17,18方面取得了进展。
已经开发了定向分化方案来概括体内发育里程碑,以产生人诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的2型肺泡上皮细胞(iAT2s)19。iAT2s在含有CHIR99021,KGF,地塞米松,cAMP和称为“CK + DCI”19的3D无血清培养基中作为自我更新球体生长,在没有成纤维细胞饲养器的情况下,可以培养>20,20传代20,21。此外,iAT2与人类成年原代AT2共享转录组学程序,形成层状体,并产生和包装表面活性剂19,21,22。该协议通过将细胞解离为单细胞悬浮液来详细说明iAT2s的串行传代。此时,iAT2s可以在3D培养物中重新镀层并进一步扩增,或在2D ALI培养物23中镀层。这些方法可用于研究AT2在体内平衡和疾病20,22中的内在生物学,并在可扩展的,生理相关的平台23,24中询问化合物或刺激的作用,如前所述。
Protocol
所有涉及人类iPSC系分化的实验均按照波士顿大学机构审查委员会(协议H33122)进行。在密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院人类研究保护办公室的批准下,从供体那里获得用于重编程为iPSC的真皮成纤维细胞,经书面知情同意从供体处获得。
1. 肺泡层解离
- 根据 表1中提到的组合物制备完全无血清的分化培养基(cSFDM)。
- 按照 表2在制备的cSFDM碱基中制备CK + DCI培养基。
- 根据实验需要,在冰上解冻2D(人胚胎干细胞合格)和/或3D(生长因子减少)基质。
- 使用移液器或吸出移液器从含有来自定向分化19的3D基质液滴的真空中吸取所有CK + DCI培养基,在12孔板中。
- 每滴加入1毫升分散酶(2毫克/毫升)。使用P1000移液器轻轻地将液滴移入分散酶中。在37°C下孵育1小时,30分钟后上下移液一次。
- 将解离的类器官(从步骤1.5开始)从分散酶中的一个基质液滴转移到15mL锥形管中。要洗涤,请加入10 mL Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM,参见 材料表)。
- 在室温下以300× g 离心5分钟。使用移液器或真空吸出移液器吸出上清液,留下尽可能少的上清液。
注意:重要的是要去除所有分散酶,因为任何剩余的分散酶都可能溶解细胞随后接种的基质。如果在沉淀上方看到透明的雾霾,则分散酶尚未完全溶解基质,并且可以在37°C下将更多分散酶再添加到沉淀中20-30分钟。 - 将细胞重悬于1mL每滴0.05%胰蛋白酶中,并转移回12孔板。在37°C下孵育12-15分钟。在显微镜下观察解离。避免在此阶段过度移液细胞。
注意:在孵育结束时,细胞需要在用P1000移液管移液3-5次后实现单细胞悬浮液。对于将iaT2传代到ALI(步骤3),胰蛋白酶消化时间需要最小化(最大12分钟),使得当准备接种到细胞培养插入物上时,细胞处于2-3细胞团块中而不是单细胞悬浮液中。 - 用等体积的含FBS培养基(DMEM中10%ES合格的FBS)停止胰蛋白酶的作用。在室温下以300× g 离心5分钟。
- 用10mL IMDM洗涤细胞。在室温下以300× g 离心5分钟。
- 将细胞重悬于适当的体积中以进行计数,然后使用血细胞计数器计数细胞(参见 材料表)。
注意:从一个融合的50μL基质液滴以400个细胞/ μL接种,预期产量为每片500,000至1.5 x 106 个细胞。 - 使用iAT2细胞的单细胞悬浮液通过在3D基质中接种(步骤2)和/或在用于ALI培养的细胞培养插入物上接种(步骤3)来产生肺泡球。
2.3D iAT2 的电镀
- 计数后(步骤1.11),确定要在3D基质中再表达的所需细胞的数量(400个细胞/ μL基质,每孔12孔板具有50-100μL3D基质液滴)。在室温下以300× g 离心细胞5分钟。使用移液器去除尽可能多的上清液。
- 重悬 3D 矩阵中的单元格。如果需要,快速重悬于冰上,以防止基质聚合(加热时发生)。
- 使用P200移液器将每孔一个3D基质液滴分配到预热的12孔板中。小心移液,以避免在基质液滴中产生气泡。在分配多个液滴时,不要让细胞悬浮液沉降。
- 将板置于37°C培养箱中20-30分钟,以使基质液滴聚合。
- 每孔加入1 mL CK + DCI + 10μM的Y-27632培养基(参见 材料表)以覆盖基质液滴。
- 72小时后,将培养基更换为CK + DCI,没有10μM的Y-27632。
- 每48-72小时用新鲜的CK + DCI替换培养基。
注意:iAT2通常需要大约每10-14天传代一次,具体取决于细胞系和接种密度。
3. 将 iAT2 传递给 ALI
- 在使用前1小时准备新鲜包被的6.5mm细胞培养物插入物,方法是将Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12(DMEM / F12)中的2D基质稀释到工作溶液中,按照制造商对2D基质的说明(参见 材料表)。然后,每6.5mm细胞培养插入物中加入100μL稀释基质。让基质在37°C培养箱中聚合30分钟或在室温下聚合1小时。
- 使用移液器或真空吸出移液器从细胞培养插入物中吸出多余的基质,并用DMEM / F12冲洗一次。在加入细胞之前立即吸出该洗涤液。
- 计数后,确定在培养插入片段中接种所需细胞数所需的细胞数(520,000活细胞/ cm2,相当于每6.5mm细胞培养插入物172,000个活细胞)。在室温下以300× g 离心细胞5分钟。尽可能多地去除上清液。
- 以适当的体积重悬细胞以接种每个细胞培养插入物100μL CK + DCI + 10μM Y-27632(细胞悬浮液应为1,720个细胞/ μL)。向细胞培养插入物的顶端室中加入100μL。以交叉模式轻轻搅拌板,以确保细胞在细胞培养插入物上均匀分布,并通过在显微镜下以4x物镜检查来确认这一点。
注意:接种密度至关重要,可能需要优化,范围为每6.5mm细胞培养插入物160,000-300,000个细胞。钙黄绿素(参见 材料表)细胞渗透染料可以添加到细胞中,并在倒置荧光显微镜上观察,以在接种后可视化细胞。 - 向每个细胞培养插入物的基底外侧室中加入500μL CK + DCI + 10μM的Y-27632。
- 吸出顶端CK + DCI + 10μM的Y-27632培养基48小时后,使用移液器启动ALI(称为“气举”)。
注意:此时,细胞应100%汇合。如果细胞不是100%融合的,步骤3.7-3.8仍应在指定的时间点进行;融合细胞单层可能需要更长的时间才能形成。 - 72小时后将Y-27632培养基的基底外侧CK + DCI + 10μM更改为CK + DCI,没有10μM Y-27632。
注意:介质的顶端应有最小的“泄漏”(如果有的话)。但是,如果在最初几天确实发生这种情况,请继续每天抽吸顶端,直到没有进一步的渗漏。 - 每48-72小时用新鲜的CK + DCI替换基底外侧培养基。
注意:ALI培养物中使用的iAT2在电镀后5-14天最大成熟。 - 如果需要,在接种后仔细监测细胞长达28天,以进行更长时间的实验。
注意:在培养物中过度延长后,可以观察到ALI失败的明显迹象,例如细胞从插入物边缘剥离或在单层中形成孔,此时ALI不再可用于实验。
Representative Results
将iAT2s传代到单细胞悬浮液中,然后在3D基质中或在用于ALI培养的细胞培养插入物上以2D重镀(图1)。单细胞解离后,通过流式细胞术分析iAT2s。简而言之,在流式细胞仪上分析重悬于1%胎牛血清(FBS)中磷酸盐缓冲盐水(PBS)与钙黄绿素蓝活力染料(1:1000)的细胞,并门控非片段,单线态和tdTomato。例如,这里是SPC2系(SPC2-ST-B2克隆20),它具有靶向内源性 SFTPC 位点的tdTomato报告基因座,以便于可视化和跟踪AT2程序随时间变化在培养物中(图2A)。当作为球体在3D基质中重镀时,iAT2 SFTPC-tdTomato表达得以维持(图2B)并且当接种在细胞培养插入物上时(图2C)。可以测量经上皮电阻(TEER)以确定ALI培养物的完整性(图2D)。为了测量TEER,使用体积测量仪(参见 材料表),将100μLCK + DCI培养基添加到顶端室中。在没有接种细胞的情况下用基质胶包被的细胞培养插入物作为空白处理。在每个井的三个位置进行读数。
图 1:实验方案工作流程的示意图。请单击此处查看此图的大图。
图2:协议的代表性结果。 (A)SFTPC-tdTomato在3D培养的人诱导多能干细胞衍生的2型肺泡上皮样细胞(iAT2s)中的代表性流式细胞术结果。显示的阴性对照是非肺内皮(CD47lo)。(B)在传代后不同天以3D形式培养的iAT2的代表性活细胞成像(dpp)(SFTPC-tdTomato,比例尺= 50μm)。(C)在气液界面(SFTPC-tdTomato,比例尺= 500nm)镀层的iAT2的代表性活细胞成像。(D)在气液界面处镀层的iAT2s的代表性反上皮电阻。n = 3,误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
试剂 | 容积 500 mL | 最终浓度 |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 375 毫升 | 75% |
火腿的F-12营养混合物(F12) | 125 毫升 | 25% |
B-27(含RA)补充剂 | 5 毫升 | 1% |
N-2 补充剂 | 2.5 毫升 | 0.50% |
BSA(7.5%股票) | 3.3 毫升 | 0.05% |
铂莫星(50毫克/毫升储备) | 1 毫升 | 100微克/毫升 |
谷达麦克斯(100倍库存) | 5 毫升 | 1 倍 |
抗坏血酸(50毫克/毫升储备) | 500 微升 | 50微克/毫升 |
1-巯基甘油 (MTG)(从 26 μL 到 2 mL IMDM) | 1.5 毫升 | 4.5 x 10-4 米 |
表1:完全无血清分化培养基(cSFDM)的组成。
试剂 | 最终浓度 |
CHIR99021 | 3 微米 |
rhKGF | 10纳克/毫升 |
地塞米松 | 50 海里 |
8-溴腺苷 30,50-环磷酸钠 | 0.1 毫米 |
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | 0.1 毫米 |
表 2:CK + DCI 介质的成分。
Discussion
AT2s维持肺部稳态,这些关键肺泡细胞的功能障碍可引起各种肺部疾病。由于访问和隔离主要人类AT2的困难,产生了iAT2。通过应用其他地方描述的定向分化方法25 和此处描述的扩增和细胞接种,从任何个体产生的iPSC可以分化成稳健的自我更新的iAT2,从而为生物医学研究提供患者特异性细胞,包括基础生物医学研究发展研究,疾病建模,基于细胞的疗法或药物筛选。本方案详细介绍了将iAT2s解离为单细胞悬浮液的方法,然后可以在3D基质胶中重新接种以产生用于细胞扩增的肺泡球或在2D ALI培养物中重新电镀以进行进一步的实验。
该协议有几个关键步骤,以确保在3D和ALI培养物中成功传代和重新电镀。必须尽量减少机械性研磨,因为过度移液会降低细胞活力。此外,iAT2在3D和2D ALI培养物中的接种密度至关重要;对于3D培养,通常,400个细胞/ μL的3D基质胶对于大多数iPSC系是最佳的。然而,有时100-500个细胞/μL的密度范围是成功的,并且可能需要针对不同的细胞系优化密度。对于ALI培养,优化细胞培养插入物上iAT2s的接种密度对于在接种后48小时(即气举当天)实现细胞的融合单层也是必不可少的。一些iAT2系每次插入需要更多的细胞;因此,如果需要排除故障,建议24孔细胞培养插入物的160,000-300,000个细胞/插入片段。通过将接种密度保持在400个细胞/ μL的3D基质并将基质液滴大小分别减小到25μL和20μL,也可以将3D培养物缩放至24孔和48孔板。ALI培养物可以通过在每个插入物中涂覆30μL基质,在每个插入片段中接种80,000个细胞,每个插入片段中接种80,000个细胞,并每孔喂食150μL基底外侧培养基,将ALI培养物缩放至96孔细胞培养基。播种密度以及基质和培养基体积需要针对其他板形式进行相应缩放和优化。
该协议的局限性在于,用于ALI接种的细胞必须充分纯化为NKX2-1 +和SFTPC + 19,20,21,23以形成iAT2 ALI,并且ALI培养物的形成可能因线而异。此外,该协议允许仅扩增和生成仅AT2培养物,提供基于单个关键肺泡细胞类型的还原模型系统。重要的是,这些平台中缺少其他相关的肺泡细胞类型,例如肺泡1型细胞。其他组已成功地将原代人AT2培养成球体或有机细胞培养物,有或没有成纤维细胞1,14,15,16,17;然而,原代人AT2s在没有ALI条件的正常2D培养中培养时往往会失去关键表面活性剂的表达26。此外,最近的研究表明,iAT2s表达比新鲜,未培养的人类原代AT2s更高的增殖标志物和更低的AT2成熟标志物27。尽管iAT2s和新鲜原代人AT2之间存在这些差异,但我们发现,即使是培养的原代AT2也显示出与新鲜,未培养的原代AT2s27的转录组差异,从而得出结论,这些体外模型在体内肺生物学建模方面具有各种优势和局限性。
iAT2平台可用于研究患者来源的iPSCs19,20的基因突变。该系统还可以大幅扩大规模,以适应高通量药物筛选。此外,iAT2 ALI适用于环境暴露,例如病毒或细菌感染或暴露于香烟烟雾,电子烟蒸气或其他气溶胶23。总之,用于生成iAT2的3D和2D ALI培养物的该协议允许长期培养与疾病相关的细胞类型,并提供一个生理,可扩展的平台,使这些细胞能够在许多应用中使用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们衷心感谢威尔逊、科顿和霍金斯实验室的成员,感谢他们进行了有益的讨论。我们也非常感谢Greg Miller(CReM实验室经理)和Marianne James(iPSC核心经理)的宝贵支持。我们感谢Brian Tilton和BUMC流式细胞术核心在细胞分选方面的技术援助(由NIH拨款#1S10OD021587-01A1支持)。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会授予RBW的CJ Martin早期职业奖学金的支持;NIH向KMA授予F30HL147426;肺纤维化基金会颁发的I.M. Rosenzweig初级研究员奖,以及波士顿大学临床与转化科学研究所(1UL1TR001430)授予KDA的综合试点资助奖;瑞士国家科学基金会(P2ELP3_191217)对ABA;NIH将U01HL148692,U01HL134745,U01HL134766和R01HL095993授予DNK;NIH授予U01TR001810,R01DK101510和R01DK117940授予AAW;iPSC维护,银行和共享由NIH拨款NO1 75N92020C00005支持。图 1 是使用 Biorender.com 创建的。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
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