Schnelle viskoelastische Charakterisierung von Atemwegsschleim mit einem Tischrheometer

Summary

Die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims spielen eine entscheidende Rolle bei der schleimhäutigen Clearance. Traditionelle rheologische Schleimtechniken erfordern jedoch komplexe und zeitaufwändige Ansätze. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Tischrheometers, das schnell und zuverlässig viskoelastische Messungen durchführen kann.

Abstract

Bei muko-obstruktiven Lungenerkrankungen (z. B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Mukoviszidose) und anderen Atemwegserkrankungen (z. B. virale / bakterielle Infektionen) werden die biophysikalischen Eigenschaften des Schleims durch Becherzellhypersekretion, Atemwegsdehydrierung, oxidativen Stress und das Vorhandensein von extrazellulärer DNA verändert. Frühere Studien zeigten, dass die Viskoelastizität des Sputums mit der Lungenfunktion korrelierte und dass Behandlungen, die die Sputumrheologie beeinflussen (z. B. Mukolytika), zu bemerkenswerten klinischen Vorteilen führen können. Im Allgemeinen verwenden rheologische Messungen von nicht-newtonschen Flüssigkeiten ausgefeilte, zeitaufwändige Ansätze (z. B. parallele / Kegelplatten-Rheometer und / oder Mikroperlenpartikel-Tracking), die ein umfangreiches Training erfordern, um den Assay durchzuführen und die Daten zu interpretieren. Diese Studie testete die Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von Rheomuco, einem benutzerfreundlichen Tischgerät, das entwickelt wurde, um schnelle Messungen mit dynamischer Oszillation mit einem Scher-Dehnungs-Sweep durchzuführen, um lineare viskoelastische Moduli (G’, G^{“, G*} und tan δ) und Gelpunkteigenschaften (γ c und σ_c) für klinische Proben innerhalb von 5 Minuten bereitzustellen. Die Geräteleistung wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen eines Schleimsimulans, 8 MDa Polyethylenoxid (PEO), und anhand herkömmlicher Bulk-Rheologiemessungen validiert. Ein klinisches Isolat, das von einem intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) entnommen wurde, wurde dann in dreifachen Messungen bewertet und der Variationskoeffizient zwischen den Messungen beträgt <10%. Die Ex-vivo-Anwendung eines starken Schleimreduktionsmittels, TCEP, auf SA-Schleim führte zu einer fünffachen Abnahme des Elastizitätsmoduls und einer Veränderung hin zu einem insgesamt “flüssigkeitsähnlicheren” Verhalten (z. B. höhere Bräunung δ). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass das getestete Tischrheometer zuverlässige Messungen der Schleimviskoelastizität in klinischen und Forschungsumgebungen durchführen kann. Zusammenfassend könnte das beschriebene Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von mukoaktiven Arzneimitteln (z. B. rhDNase, N-Acetylcystein) vor Ort zu untersuchen, um die Behandlung von Fall zu Fall oder in präklinischen Studien mit neuartigen Verbindungen anzupassen.

Introduction

Muko-obstruktive Atemwegserkrankungen, einschließlich Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Mukoviszidose (CF) und andere Atemwegserkrankungen wie virale und bakterielle Lungenentzündung, sind weltweit weit verbreitete Gesundheitsprobleme. Während die Pathophysiologie zwischen den einzelnen Erkrankungen stark variiert, ist ein gemeinsames Schlüsselmerkmal eine abnormale mukoziliäre Clearance. In gesunden Lungen kleidet Schleim das Atemwegsepithel aus, um eingeatmete Partikel einzufangen und eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger zu schaffen. Nach der Sekretion wird der Atemwegsschleim, der aus ~ 97,5% Wasser, 0,9% Salz, ~ 1,1% Kugelproteinen und ~ 0,5% Schleim besteht, allmählich durch das koordinierte Schlagen von Zilien ^1,2 in Richtung der Stimmblase transportiert. Mucine sind große O-verknüpfte Glykoproteine, die über nicht-kovalente und kovalente Bindungen interagieren, um die unterschiedlichen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim bereitzustellen, die für einen effizienten Transport erforderlich^{sind 3}. Veränderungen in der Ultrastruktur des Mucin-Netzwerks, die durch veränderten Ionentransport, Mucinentfaltung, elektrostatische Wechselwirkungen, Vernetzung oder Änderungen der Zusammensetzung verursacht werden, können die Viskoelastizität des Schleims signifikant beeinflussen und die mukoziliäre Clearance^{beeinträchtigen 4,5}. Daher ist die Identifizierung von Veränderungen der biophysikalischen Eigenschaften von Atemwegsschleim für das Verständnis der Krankheitspathogenese und die Erprobung neuartiger mukoaktiver Verbindungen^{unerlässlich 6}.

Verschiedene Faktoren können zur Produktion von aberrantem Schleim in der Lunge führen. Bei COPD löst das chronische Einatmen von Zigarettenrauch eine Schleimhypersekretion als Folge der Becherzellmetaplasie sowie eine Dehydrierung der Atemwege über die Herunterregulierung des CFTR-Kanals (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) aus, was zu einer Schleimhyperkonzentration und einer Obstruktion der kleinen Atemwege führt ^7,8. In ähnlicher Weise ist CF, eine genetische Störung, die mit Mutationen im CFTR-Gen assoziiert ist, durch die Produktion von viskosem, adhärentem Schleim gekennzeichnet, der für den Transport nicht ausreicht ^8,9. Kurz gesagt, CFTR-Dysfunktion induziert die Erschöpfung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die Verschränkung des polymeren Mucins und erhöhte biochemische Wechselwirkungen, die zu chronischen Entzündungen und bakteriellen Infektionen führen. Darüber hinaus verschlimmern Entzündungszellen, die in statischem Schleim gefangen sind, die Viskoelastizität des Schleims weiter, indem sie ein weiteres großes Molekül, DNA, in die Gelmatrix geben, was die Atemwegsobstruktion^{verschlimmert 5}. Eines der besten Beispiele für die Bedeutung der Schleimrheologie für die allgemeine Gesundheit der Lunge ist das Beispiel der rekombinanten humanen DNFase (rhDNase) bei der Behandlung von Mukoviszidose-Patienten. Die Wirkungen von rhDNase wurden erstmals ex vivo auf schleimlösenden Sputum nachgewiesen, der innerhalb von Minuten^10,11 einen Übergang von viskosem Schleim zu einer fließenden Flüssigkeit zeigte. Klinische Studien an CF-Patienten zeigten, dass die Verringerung der Viskoelastizität des Atemwegsschleims mit rhDNase-Inhalation die Rate der pulmonalen Exazerbationen verringerte und die Lungenfunktion und das allgemeine Wohlbefinden des Patienten verbesserte^12,13,14. Infolgedessen wurde die rhDNase-Inhalation zur Erleichterung der Clearance für mehr als zwei Jahrzehnte zum Behandlungsstandard für CF-Patienten. Ähnliche klinische Vorteile wurden bei der Verwendung von inhalativer hypertoner Kochsalzlösung zur Schleimhydratation bei CF beobachtet, die mit Veränderungen der rheologischen Eigenschaften korrelierte und zu einer Beschleunigung der mukoziliären Clearance und einer verbesserten Lungenfunktion^{führte 15,16}. Daher ist ein schnelles und zuverlässiges Protokoll zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim in klinischen Umgebungen wichtig, um therapeutische Ansätze zu optimieren.

Das hier getestete Tischrheometer bietet eine schnelle und komfortable Alternative für die Durchführung umfassender viskoelastischer Messungen von Schleim-/Sputumproben. Unter Verwendung dynamischer Schwingungen mit kontrollierter Winkelverschiebung bietet das Gerät eine Verformung über ein Paar einstellbarer paralleler Platten (z. B. grobe oder glatte Geometrien), um das Drehmoment und die Verschiebung mit Auflösungen von 15 nN zu messen^. m und¹⁵⁰ nm bzw. 17. Eine standardisierte Standardkalibrierung in Kombination mit Benutzerrichtlinien, die für Nicht-Rheologie-Spezialisten angepasst sind, ermöglicht einfache Messungen und reduziert das Risiko von Bedienerfehlern. Das Gerät erzeugt eine Dehnungskurven, die in Echtzeit (innerhalb von ~ 5 min) verarbeitet und analysiert wird und automatisch sowohl lineare viskoelastische (G’, G^{“, G*} und tan δ) als auch gelförmige (γ c und σ_c) Eigenschaften liefert (siehe Tabelle 1). Der Elastizitäts- oder Speichermodul (G’) beschreibt, wie eine Probe auf Stress reagiert (d. h. die Fähigkeit, in ihre ursprüngliche Form zurückzukehren), während der viskose oder Verlustmodul (G) die Energie beschreibt, die pro Zyklus der sinusförmigen Verformung abgeführt wird (dh die Energie, die durch die Reibung von Molekülen verloren geht). Der komplexe oder dynamische Modul (G*) ist das Verhältnis von Spannung zu Dehnung, das das Ausmaß des inneren Kraftaufbaus als Reaktion auf eine Schubverschiebung (d. h. die gesamten viskoelastischen Eigenschaften) beschreibt. Der Dämpfungsfaktor (tan δ) ist das Verhältnis des viskosen Moduls zum Elastizitätsmodul, was die Fähigkeit einer Probe angibt, Energie abzuleiten (d. h. eine niedrige Bräunung δ zeigt ein elastisch-dominantes/feststoffähnliches Verhalten an, während ein hoher Bräunungs-δ ein viskos-dominantes/flüssigkeitsähnliches Verhalten anzeigt). Für Gelpunkteigenschaften ist die Übergangsdehnung (γ_c) das Maß der Scherdehnung, berechnet durch das Verhältnis des Umlenkweges zur Scherspalthöhe, bei der die Probe von einem feststoffähnlichen zu einem flüssigkeitsähnlichen Verhalten übergeht und definitionsgemäß bei Schwingungsdehnung auftritt, wobei G’ = G” oder tan δ = 1 ist. Die Übergangsfließspannung (σ_c) ist ein Maß für die Höhe der Spannung, die von der Vorrichtung ausgeübt wird, bei der sich die elastischen und viskosen Module kreuzen. Bei gesunden Sputa dominiert die Elastizität die mechanische Reaktion auf Dehnung (G’ > G”). Bei muko-obstruktiven Erkrankungen nehmen sowohl G’ als auch “G” infolge pathologischer Schleimveränderungen^{zu 17,18,19}. Die einfache Bedienung des Geräts erleichtert Messungen vor Ort und umgeht die Notwendigkeit der Lagerung / des Transports / des Versands von Proben zu einer externen Einrichtung zur Analyse, wodurch die Zeit- und Frost-Tau-Effekte auf die Eigenschaften dieser biologischen Proben vermieden werden.

In dieser Studie wurden 8 MDa-Polyethylenoxid (PEO)-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (1%-3%) verwendet, um den Messbereich eines handelsüblichen Tischrheometers (Table of Materials) zu validieren, und die erhaltene konzentrationsabhängige Kurve wurde direkt mit Messungen verglichen, die mit einem herkömmlichen Bulk-Rheometer (Table of Materials) durchgeführt wurden. ). Die Wiederholbarkeit der rheologischen Messungen wurde dann anhand von bronchoskopisch geerntetem Schleim eines intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) beurteilt, einer extremen Form der Asthma-Exazerbation, die durch Bronchospasmus, eosinophile Entzündungen und Schleimhyperproduktion als Reaktion auf einen Umwelt- oder Infektionserreger gekennzeichnet ist^8,20 . In diesem Fall war der SA-Patient wegen schwerer Ateminsuffizienz intubiert worden und benötigte ECMO (extrakorporale Membranoxygenierung), da der Patient trotz aggressiver Standard-Asthmatherapien nicht allein mit mechanischer Beatmung effektiv und sicher unterstützt werden konnte. Während einer klinisch indizierten Bronchoskopie für den Lobarkollaps wurden dicke, klare, hartnäckige Sekrete festgestellt, die die Lobarbronchien verstopften und mit Kochsalzwaschungen abgesaugt wurden. Unmittelbar nach der Entnahme wurde überschüssige Kochsalzlösung aus dem Aspirat entfernt und die viskoelastischen Eigenschaften der verbleibenden SA-Probe mit dem Tischgerät analysiert. Zusätzliche Probenaliquots wurden mit einem Reduktionsmittel, Tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), behandelt, um festzustellen, ob dieses Protokoll zur Charakterisierung der therapeutischen Wirkstoffwirksamkeit ex vivo verwendet werden könnte.

Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Protokoll und das Tischgerät effektiv in einer klinischen Umgebung eingesetzt werden können. Die aus PEO-Konzentrationskurven (Abbildung 1A) ermittelten rheologischen Eigenschaften waren zwischen dem getesteten Tischgerät und einem herkömmlichen parallelen Plattenrheometer nicht zu unterscheiden (Abbildung 1B). Dreifache Messungen des SA-Schleims waren wiederholbar, mit einem Variationskoeffizienten von 10% für G*-, G’- und G”-Endpunkte und spiegelten die erheblichen Anomalien der Schleimviskoelastizität wider, die im Fall dieses Patienten klinisch offensichtlich waren (Abbildung 1D). Schließlich führte die Ex-vivo-Behandlung mit TCEP zu einer signifikanten Reduktion von G’ und G” und einer Zunahme der Bräunungs δ, was zeigt, dass sie durch Veränderungen im Mucin-Netzwerk auf die Behandlung ansprechen (Abbildung 2). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll mit einem Tischrheometer einen einfachen und effektiven Ansatz zur Beurteilung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleimproben aus der Klinik bietet. Diese Fähigkeit kann verwendet werden, um präzisionsmedizinische Ansätze für die Versorgung zu erleichtern, da Kliniker die Wirksamkeit zugelassener mukoaktiver Medikamente vor Ort testen können, was dazu beitragen kann, alternative Behandlungsoptionen zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz in klinischen Studien eingesetzt werden, um die Wirkung von Prüfpräparaten zu untersuchen.

Protocol

In der vorliegenden Studie wurden Proben während einer klinisch indizierten Bronchoskopie gesammelt, nachdem die Einwilligung nach Aufklärung gemäß einem vom UNC Institutional Review Board genehmigten Protokoll eingeholt worden war. 1. Sputum-/Schleimsammlung und -lagerung Sammeln Sie Atemwegsschleim durch Sputumsammlung oder Bronchoskopie-Aspiration. Sammeln Sie Sputum entweder durch spontanen Auswurf oder induzieren Sie Sputum durch 3%…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Genauigkeit und Wiederholbarkeit rheologischer Messungen unter Verwendung konzentrationsabhängiger Kurven der viskoelastischen Kontrolle, d. h. Polyethylenoxid (PEO)-Lösung, und Status asthmaticus (SA)-schleim. Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von 8 MDa PEO bei fünf verschiedenen Konzentrationen (1%, 1,5%, 2%, 2,5% und 3%) wurden direkt zwischen dem ausgewerteten Tischrheometer und einem traditionellen Bulk-Rheometer verglichen (Werkstofftabelle</…

Discussion

Die einzigartigen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim sind für die Erhaltung gesunder Atemwege unerlässlich. Interne und externe Faktoren können die biophysikalischen Eigenschaften des Atemwegsschleims verändern und klinische Komplikationen verursachen, die für schleimobstruktive Erkrankungen charakteristisch sind. Daher könnte die Überwachung von Veränderungen der Schleimviskoelastizität bei der Beurteilung des Krankheitsstatus und der Erforschung von Therapien, die die Viskoelastizität des Schleims red…

Materials

Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.