Rask viskoelastisk karakterisering av Airway Mucus ved hjelp av et benkeplate-reometer

Summary

De viskoelastiske egenskapene til slim spiller en kritisk rolle i mucociliary clearance. Imidlertid krever tradisjonelle slim reologiske teknikker komplekse og tidkrevende tilnærminger. Denne studien gir en detaljert protokoll for bruk av et benkeplate-reometer som raskt og pålitelig kan utføre viskoelastiske målinger.

Abstract

Ved slim-obstruktive lungesykdommer (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, cystisk fibrose) og andre luftveissykdommer (f.eks. virus/bakterielle infeksjoner), endres slimbiofysiske egenskaper ved begercellehypersekresjon, luftveisdehydrering, oksidativt stress og tilstedeværelse av ekstracellulært DNA. Tidligere studier viste at sputumviskoelastisitet korrelert med lungefunksjon og at behandlinger som påvirker sputumreologi (f.eks. mukolytika) kan gi bemerkelsesverdige kliniske fordeler. Generelt benytter reologiske målinger av ikke-newtonske væsker forseggjorte, tidkrevende tilnærminger (f.eks. parallelle/kjegleplate-revometere og/eller mikrobeadpartikkelsporing) som krever omfattende opplæring for å utføre analysen og tolke dataene. Denne studien testet påliteligheten, reproduserbarheten og følsomheten til Rheomuco, en brukervennlig stasjonær enhet som er designet for å utføre raske målinger ved hjelp av dynamisk oscillasjon med en skjærstammesveip for å gi lineær viskoelastisk moduli (G’, G”, G ^* og tan δ) og gelpunktegenskaper (γ_c og σ_c) for kliniske prøver innen 5 min. Enhetens ytelse ble validert ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av et slimsimulerende middel, 8 MDa polyetylenoksid (PEO), og mot tradisjonelle bulkreologimålinger. En klinisk isoler høstet fra en intubert pasient med status astmaticus (SA) ble deretter vurdert i triplikatmålinger og variasjonskoeffisienten mellom målingene er <10%. Ex vivo bruk av et potent slimreduserende middel, TCEP, på SA-slim resulterte i en fem ganger reduksjon i elastisk modulus og en endring mot en mer “væskelignende” oppførsel generelt (f.eks. høyere brunfarge δ). Sammen viser disse resultatene at det testede benkeplatens reometer kan gjøre pålitelige mål på slimviskoelastisitet i kliniske og forskningsmiljøer. Oppsummert kan den beskrevne protokollen brukes til å utforske effekten av mukoaktive legemidler (f.eks. rhDNase, N-acetyl cystein) på stedet for å tilpasse behandlingen fra sak til sak, eller i prekliniske studier av nye forbindelser.

Introduction

Muco-obstruktive luftveissykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), cystisk fibrose (CF) og andre respiratoriske tilstander, som viral og bakteriell lungebetennelse, er utbredte helseproblemer over hele verden. Mens patofysiologien varierer sterkt mellom hver tilstand, er en vanlig nøkkelfunksjon unormal mucociliary clearance. I sunne lunger linjer slim luftveisepitelet for å fange inhalerte partikler og gi en fysisk barriere mot patogener. Når det er utskilt, blir luftveisslim, sammensatt av ~ 97,5% vann, 0,9% salt, ~ 1,1% kuleformede proteiner og ~ 0,5% mucins, gradvis transportert mot glottis ved koordinert juling av cilia ^1,2. Mucins er store O-koblede glykoproteiner som samhandler via ikke-kovalente og kovalente bindinger for å gi de distinkte viskoelastiske egenskapene til slim, som kreves for effektiv transport³. Endringer i ultrastruktur av mucinnettverket forårsaket av endret iontransport, mucin utfoldelse, elektrostatiske interaksjoner, krysskobling eller endringer i sammensetningen kan påvirke slimviskoelastisiteten betydelig og svekke mukopiliarclearance ^4,5. Derfor er identifisering av endringer i de biofysiske egenskapene til luftveisslim avgjørende for å forstå sykdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser⁶.

Ulike faktorer kan føre til produksjon av avvikende slim i lungene. Ved KOLS utløser kronisk innånding av sigarettrøyk slimhyperseretion som følge av begercellemetasi, samt luftveisdehydrering via nedregulering av den cystiske fibrosetransmembrane ledningsregulatoren (CFTR) -kanalen, forårsaker slim hyperkonsentrasjon og liten luftveisobstruksjon ^7,8. På samme måte er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutasjoner i CFTR-genet, preget av produksjon av viskøs, tilhengerslim som er utilstrekkelig for transport ^8,9. Kort sagt, CFTR dysfunksjon induserer luftveier overflate væske uttømming, polymer mucin innvikling, og økt biokjemisk interaksjoner, noe som resulterer i kronisk betennelse og bakterielle infeksjoner. I tillegg forverrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim ytterligere viscoelasticity av slim ved å legge til et annet stort molekyl, DNA, inn i gelmatrisen, forverre luftveisobstruksjon⁵. Et av de beste eksemplene på betydningen av slimreologi på lungenes generelle helse er gitt av eksempelet på rekombinant human DNFase (rhDNase) i behandlingen av cystiske fibrosepasienter. Effektene av rhDNase ble først demonstrert ex vivo på eksorated sputum, som viste en overgang fra viskøs slim til en flytende væske i løpet av minutter^10,11. Kliniske studier hos CF-pasienter viste at reduksjon av luftveisslim viskoelastisitet med rhDNase-innånding reduserte frekvensen av lungeforverringer, og forbedret lungefunksjon og generell pasienttilpasning 12,13,14. Som et resultat ble rhDNase-innånding med sikte på å lette clearance standarden for omsorg for CF-pasienter i mer enn to tiår. Lignende kliniske fordeler ble observert ved bruk av inhalert hypertonisk saltvann for slimhydrering i CF, som korrelerte med endringer i reologiske egenskaper og resulterte i mukociliær clearance akselerasjon og forbedret lungefunksjon^15,16. Derfor er en rask og pålitelig protokoll for å måle slimviskoelastiske egenskaper i kliniske omgivelser viktig for å optimalisere terapeutiske tilnærminger.

Benkeplatens reometertestet heri gir et raskt og praktisk alternativ for å utføre omfattende viskoelastiske målinger av slim/ sputumprøver. Ved hjelp av dynamiske svingninger med kontrollert vinkelforskyvning gir instrumentet deformasjon via et par justerbare parallelle plater (f.eks. grove eller glatte geometrier) for å måle dreiemomentet og forskyvningen med oppløsninger på 15 nN^. henholdsvis m og 150^nm. En standardisert kalibrering kombinert med brukerretningslinjer tilpasset ikke-reologispesialister gir enkel måling og reduserer risikoen for operatørfeil. Enheten produserer en strekksveipkurve som behandles og analyseres i sanntid (innen ~5 min) og gir automatisk både lineære viskoelastiske (G’, G”, G^*, og tan δ) og gelpunktegenskaper (γ_c og σ_c) (se tabell 1). Den elastiske eller lagringsmodulus (G’) beskriver hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til å gå tilbake til sin opprinnelige form), mens viskøs eller tap modulus (G”) beskriver energien dissipated per syklus av sinusformet deformasjon (dvs. energien tapt på grunn av friksjon av molekyler). Den komplekse eller dynamiske modulusen (G*) er forholdet mellom stress og belastning, som beskriver mengden intern kraftoppbygging som svar på en skjæreforskyvning (dvs. de generelle viskoelastiske egenskapene). Dempingsfaktoren (brunfarge δ) er forholdet mellom det viskøse moduluset og det elastiske moduluset, som indikerer en prøves evne til å spre energi (dvs. en lav brunfarge δ indikerer en elastisk dominerende / solid-lignende oppførsel, mens en høy brunfarge δ indikerer en viskøs-dominerende / væskelignende oppførsel). For gelpunktegenskaper er crossoverstammen (γ_c) målet på skjærstammen, beregnet av forholdet mellom avbøyningsbanen og skjærgaphøyden, hvor prøven går fra en solid-lignende til en væskelignende oppførsel og oppstår per definisjon ved oscillasjonsstamme der G ‘ = G” eller brunfarge δ = 1. Crossover yield stress (σ_c) er et mål på mengden stress som påføres av enheten der den elastiske og viskøse moduli krysser. I sunn sputa dominerer elastisitet den mekaniske responsen på belastning (G’ > G”). Ved slim-obstruktive sykdommer øker både G’ og G” som følge av patologiske slimendringer 17,18,19. Den operative enkelheten til enheten letter målinger på stedet og omgår behovet for prøvelagring / transport / forsendelse til et anlegg utenfor stedet for analyse og dermed unngå tid og fryse-tine effekter på egenskapene til disse biologiske prøvene.

I denne studien ble 8 MDa polyetylenoksid (PEO) løsninger av forskjellige konsentrasjoner (1%-3%) brukt til å validere måleområdet til et kommersielt benkeplate-reometer (Materialfortegnelse) og den oppnådde konsentrasjonsavhengige kurven ble direkte sammenlignet med målinger oppnådd med et tradisjonelt bulkreometer (Tabell over materialer) ). Repeterbarheten av reologiske målinger ble deretter vurdert ved hjelp av bronkoskopisk høstet slim fra en intubert pasient som lider av status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforverring preget av bronkospasme, eosinofil betennelse og slimhyperproduksjon som svar på et miljø- eller smittsomt middel ⁸²⁰ . I dette tilfellet hadde SA-pasienten blitt intubert for alvorlig åndedrettssvikt og krevde ECMO (ekstrakorporeal membranoksygenering) på grunn av manglende evne til å støtte pasienten effektivt og trygt med mekanisk ventilasjon alene, til tross for aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indikert bronkoskopi for lobarkollaps ble tykke, klare, tålmodige sekreter bemerket å hindre lobar bronkier og ble aspirert ved hjelp av saltvannsvask. Umiddelbart etter innsamling ble overflødig saltvann fjernet fra aspireringen, og de viskoelastiske egenskapene til den gjenværende SA-prøven ble analysert ved hjelp av benkplatenheten. Ytterligere prøve aliquots ble behandlet med et reduksjonsmiddel, tris (2-karboksylethyl) fosfinhydroklorid (TCEP), for å avgjøre om denne protokollen kan brukes til å karakterisere terapeutisk sammensatt effekt ex vivo.

Resultatene viste at denne protokollen og benkeplaten kan brukes effektivt i en klinisk setting. De revologiske egenskapene som ble bestemt fra PEO konsentrasjonsavhengige kurver (figur 1A) var uutslettelige mellom den testede benkeplaten og et tradisjonelt parallellplaterometer (figur 1B). Triplikatmålinger av SA-slimet var repeterbare, med en 10 % variasjonskoeffisient for G*-, G- og G-endepunkter og reflekterte de betydelige abnormitetene i slimviskoelastisitet som var klinisk tydelige i denne pasientens tilfelle (figur 1D). Til slutt resulterte ex vivo-behandling med TCEP i en betydelig reduksjon i G’ og G”, og en økning i brunfarge δ, noe som viste respons på behandlingen ved endringer i mucinnettverket (figur 2). Til slutt gir denne protokollen ved hjelp av et benkeplate-reometer en enkel og effektiv tilnærming for å vurdere viskoelastiske egenskaper til slimprøver hentet fra klinikken. Denne evnen kan brukes til å lette presisjonsmedisinske tilnærminger til omsorg, da klinikere kan teste effekten av godkjente mukoaktive legemidler på stedet, noe som kan bidra til å identifisere alternative behandlingsalternativer. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes i kliniske studier for å undersøke effekten av undersøkelsesmedisiner.

Protocol

I den nåværende studien ble det samlet inn prøver under en klinisk indikert bronkoskopi etter å ha innhentet informert samtykke i henhold til en protokoll godkjent av UNC Institutional Review Board. 1. Sputum / slim samling og lagring Samle airway slim via sputum samling eller bronkoskopi aspirasjon. Samle sputum enten via spontan ekspektorasjon eller indusere sputum med 3% hypertonisk saltvannsinhalasjon. Alternativt kan du direkte aspi…

Representative Results

Figur 1 viser nøyaktigheten og repeterbarheten av reologiske målinger ved hjelp av konsentrasjonsavhengige kurver av viskoelastisk kontroll, det vil si polyetylenoksid (PEO)-løsning og status astmaticus (SA) slim. Målinger av viskoelastiske egenskaper ved 8 MDa PEO ved fem forskjellige konsentrasjoner (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) ble direkte sammenlignet mellom det evaluerte benkeplatens reometer og et tradisjonelt bulkreometer (Materialtabell). I motsetning til SA-slim va…

Discussion

De unike viskoelastiske egenskapene til slim er avgjørende for å opprettholde sunne luftveier. Interne og eksterne faktorer kan endre luftveis slimbiofysiske egenskaper, noe som forårsaker kliniske komplikasjoner som er karakteristiske for slim-obstruktive sykdommer. Derfor kan overvåking av endringer i slimviskoelastisitet vurderes under vurderinger av sykdomsstatus og utforskning av terapier som reduserer slimviskoelastisitet. Empiriske studier fra 1980-tallet viste en sterk sammenheng mellom slimreologi og luftvei…

Materials

Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.