Дифференциальная динамическая микроскопия (ДДМ) сочетает в себе особенности динамического рассеяния света и микроскопии. Здесь представлен процесс использования DDM для характеристики восстановленных цитоскелетных сетей путем количественной оценки субдиффузной и клеточной динамики частиц в виментиновых сетях и баллистического движения активных миозин-управляемых актин-микротрубочек композитов.
Клетки могут ползать, самовосстанавливаться и настраивать свою жесткость из-за их удивительно динамичного цитоскелета. Таким образом, восстановление сетей цитоскелетных биополимеров может привести к появлению множества активных и адаптируемых материалов. Однако разработка таких материалов с точно настроенными свойствами требует измерения того, как динамика зависит от состава сети и методов синтеза. Количественная оценка такой динамики оспаривается вариациями во времени, пространстве и пространстве формулирования составных сетей. Протокол здесь описывает, как метод анализа Фурье, дифференциальная динамическая микроскопия (DDM), может количественно оценить динамику биополимерных сетей и особенно хорошо подходит для исследований сетей цитоскелетов. DDM работает над временными последовательностями изображений, полученных с использованием ряда методов микроскопии, включая лазерное сканирование конфокальной, широкоугольной флуоресценции и ярко-полевой визуализации. Из таких последовательностей изображений можно извлечь характерные времена декорреляции флуктуаций плотности по диапазону волновых векторов. Также разработан удобный для пользователя пакет Python с открытым исходным кодом для выполнения DDM-анализа. С помощью этого пакета можно измерить динамику меченых компонентов цитоскелета или встроенных индикаторных частиц, как показано здесь с помощью данных сетей промежуточных нитей (виментина) и активных сетей актин-микротрубочек. Пользователи, не имеющие опыта программирования или обработки изображений, смогут выполнять DDM с помощью этого программного пакета и связанной с ним документации.
Цитоскелет представляет собой сеть белковых нитей, которая охватывает цитоплазму эукариотических клеток, соединяя клеточную поверхность с ядром. Он обладает уникальными свойствами материала, обеспечивая механическую защиту от больших и повторяющихся механических нагрузок, а также приводя к динамическим изменениям формы ячейки1. Восстановленные цитоскелетные сети могут привести к целому ряду интересных динамических поведений, от клетки встроенных частиц до баллистического движения, управляемого молекулярными двигателями 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Методы анализа динамики таких сетей включают отслеживание движения встроенных микросфер-индикаторов 6,7,12,13,14, анализ изображений для отслеживания размера белково-плотных кластеров с течением времени8, динамическое рассеяние света15, велоциметрию изображения частиц 4,16,17,18,19 , вычисление мощности спектральной плотности изображений с течением времени19, и анализ кимографа20. По мере того, как проводится больше исследований восстановленных сетей цитоскелетов, будь то понимание клеточной механики или активной материи, все более необходимы надежные, непредвзятые и воспроизводимые методы характеристики динамики. Дифференциальная динамическая микроскопия (DDM)21,22, относительно новый метод, который использовался для изучения динамики цитоскелетов, является одним из таких методов, который эффективно количественно определяет динамику с несколькими пользовательскими параметрами. С помощью программного пакета, описанного здесь, исследователи с небольшим опытом в программировании или анализе изображений смогут использовать DDM для своей собственной работы.
DDM – это метод анализа изображений для извлечения динамики образца. Подобно отслеживанию частиц или велоциметрии изображений частиц, DDM требует временных рядов изображений (часто тысяч изображений), обычно записываемых с помощью микроскопа. В отличие от отслеживания частиц, отдельные объекты или трассирующие шарики не должны локализоваться (или даже быть локализуемыми) на изображении. В отличие от отслеживания частиц и велоциметрии изображений частиц, один восстанавливает динамику ансамбля с помощью DDM с относительно небольшим количеством заданных пользователем параметров. С помощью DDM изображения анализируются в пространстве Фурье для определения времени распада флуктуаций плотности в диапазоне волновых чисел, q, где q = 2πu, а u — величина пространственных частот, . Один получает информацию, похожую на рассеяние, но с реальными космическими изображениями, полученными намикроскопе 21,22,23. Таким образом, можно воспользоваться преимуществами различных контрастообразующих методов микроскопии, таких как широкоугольная флуоресценция22,24, конфокальная флуоресценция25,поляризованная 26, темное поле27 или флуоресценция светлого листа28 микроскопий. Кроме того, изображения, используемые для DDM-анализа, могут использоваться для отслеживания частиц или велоциметрии изображений частиц для предоставления дополнительной информации.
Это сочетание функций динамического рассеяния света и оптической микроскопии делает DDM мощным и универсальным методом. С момента своего первого описания Cerbino и Trappe в 2008году 21, где было продемонстрировано, что DDM измеряет диффузию коллоидных частиц 73 нм, DDM использовался для измерения протекающих коллоидов29, коллоидной агрегации30,31, вязкоупругости нематических жидких кристаллов26, динамики коллоидных гелей32, огрубеющих пен33, наночастиц в замкнутых средах34, 35,36,37, бактериальная подвижность 38,39,40,41, диффузия слабо рассеянных белковых кластеров42, капиллярные волны на границах разделажидкости 43 и другие системы. Те, кто ищет более полный список публикаций, использующих DDM, могут обратиться к тщательным обзорным документам по этому вопросу 22,23,44,45.
DDM также использовался для исследования динамики биологических сетей. Drechsler et al. использовали DDM для измерения динамики актина в живых ооцитах дрозофилы 46. Burla et al. количественно оценили динамику индикаторных частиц в сетях гиалуроновой кислоты и гиалуронан-коллагеновых композитов47. Несколько применений DDM для изучения динамики индикаторных частиц в восстановленных цитоскелетных сетях 9,10, транспорта молекул ДНК в таких сетях48,49 и динамики активных восстановленных сетей также были задокументированы 11,50,51. ПреимуществоМ DDM при измерении динамики в таких системах является то, что отдельные частицы или молекулы не нужно локализовать и отслеживать. Так, например, динамика молекул ДНК в переполненных средах может быть измерена с помощью DDM, несмотря на сложность отслеживания таких маленьких и несферических молекул. Кроме того, с помощью флуоресцентной микроскопии можно использовать многоцветную маркировку для выборочного измерения динамики отдельных компонентов в сложном композите.
Для выполнения DDM со временем создается последовательность изображений I(x,y,t). Для заданного времени задержки, Δt, находят все (или подмножество) пар изображений, разделенных этим временем задержки. Квадратное преобразование Фурье разности каждой пары,
вычисляется и усредняется вместе. Эта величина, , радиально усредняется, при условии, что динамика изотропна. Это дает матрицу DDM (также называемую функцией структуры изображения),
. Этот процесс показан графически на рисунке 1. Чтобы определить динамику образца по этой DDM-матрице, предполагается, что DDM-матрица принимает вид
где A — амплитуда, которая зависит от деталей микроскопа и структуры образца, B — фон, который зависит от шума на изображениях, а f (q, Δt) — промежуточная функция рассеяния (ISF), содержащая информацию о динамике21,22. В простых случаях
где τ — характерное время распада или декорирования. Такой ISF был использован в нескольких исследованиях, использующих DDM на эргодических системах, таких как разбавленные коллоидные суспензии 21,24,27,37,40,52. Однако другие формы ISF могут быть использованы для моделирования различных типов динамики. Например, можно использовать кумулятивное расширение для моделирования ISF для полидисперсных образцов как
где μ — мера полидисперсности42,53; Если флуктуации плотности распадаются на два отдельных режима, можно использовать ISF, подобный
26, 54, 55, 56, 57;
другие ISF могут быть использованы для плавания микроорганизмов или других активных частиц 38,39,40,41,58,59.
Рисунок 1: Обзор DDM-анализа. Из временных рядов изображений вычисляется преобразование Фурье разности изображений для вычисления матрицы DDM. Матрица DDM может быть адаптирована к модели для определения временной шкалы флуктуаций плотности в диапазоне значений q . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь описано использование программного пакета DDM-анализа, разработанного на Python, PyDDM. Этот программный пакет основан на работе, проделанной нашими исследовательскими лабораториями и другими опубликованными исследованиями за последние несколько лет. Основными мотиваторами для создания этого программного пакета являются необходимость (1) отслеживания и хранения метаданных и параметров, используемых в анализе; (2) тщательная документация с подробными примерами анализа от начала до конца; и 3) простой способ использования различных (или создания новых) математических моделей для подгонки данных (например, добавление моделей ISF, таких как модели, недавно разработанные для активных нитей60, было бы простым). Существуют и другие программные пакеты для DDM-анализа, хотя не все они хорошо документированы и написаны на языке программирования с открытым исходным кодом. Например, есть код C++ с вычислениями на GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, код C++, использующий преобразования Фурье во времени для ускорения вычислений (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, версии MATLAB и Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, код MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 и код MATLAB с количественной оценкой неопределенности ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Поскольку этот пакет PyDDM хорошо документирован и обеспечивает большую гибкость в том, как рассчитывается и анализируется матрица DDM, он, как мы надеемся, может быть полезен для исследователей, желающих реализовать DDM, независимо от их опыта в программировании или анализе изображений.
Протокол показывает, как этот программный пакет может быть использован для количественной оценки динамики восстановленных цитоскелетных сетей in vitro . Это делается с использованием двух различных наборов данных визуализации: (1) изображений субмикронных индикаторных частиц, встроенных в виментиновую сеть, сделанных с помощью микроскопии яркого поля, и (2) изображений флуоресцентно меченых нитей актина и микротрубочек в запутанной композитной сети с активностью, управляемой миозином, взятой с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Анализ этих двух наборов данных подчеркивает заметные сильные стороны DDM, в том числе его способность анализировать изображения, сделанные с помощью различных методов визуализации (например, яркой или конфокальной флуоресценции), извлекать динамику либо из встроенных индикаторов, либо из меченых нитей и количественно оценивать различные динамики (например, субдиффузивную и ограниченную или баллистическую).
Программный пакет, описанный здесь, использует DDM для анализа флуктуаций плотности, наблюдаемых на изображениях, полученных с помощью оптического микроскопа. Впервые были показаны репрезентативные результаты из данных индикаторных частиц, встроенных в виментиновые сети. Анализ таких данных может быть использован для характеристики размера ячеек и жесткости сети аналогично тому, как отслеживание одиночных частиц использовалось во многих прошлых исследованияхсетей цитоскелетов 6,12,13. Преимущество использования DDM по сравнению с отслеживанием одной частицы заключается в том, что DDM не требует локализации частиц. Поэтому даже на изображениях, где плотность частиц слишком высока или частицы слишком малы для локализации и отслеживания, DDM все еще может определять динамику. Где отслеживание одной частицы было бы предпочтительнее, так это при проверке изменчивости частицы к частице. С DDM можно найти усредненную динамику ансамбля, тогда как при отслеживании одной частицы можно вычислить как MSD одной частицы, так и MSD ансамбля. Тем не менее, DDM можно использовать для исследования гетерогенной динамики путем анализа нескольких областей интереса в большом поле зрения.
Далее были показаны репрезентативные результаты из данных флуоресцентно меченых нитей в активной сети, состоящей из двух различно меченых типов цитоскелетных нитей11. С помощью этих данных баллистическое движение было охарактеризовано без необходимости каких-либо локализуемых особенностей в изображении. Поскольку DDM извлекает ансамблевую усредненную динамику с небольшим количеством пользовательских входных данных, это делает сравнение серий изображений, полученных с различными условиями, простым (например, сравнение образцов с различным отношением актина к микротрубочкам или образцов с различными концентрациями миозина, как это сделано в50). Кроме того, используя флуоресцентную визуализацию, мы можем исследовать динамику различных компонентов сети с помощью многоцветной маркировки. Это было сделано в 11,50, где динамика актина и микротрубочек была отдельно проанализирована в активной композитной сети актин-микротрубочки с использованием многоцветной визуализации. В разделе репрезентативных результатов здесь были показаны только результаты из канала микротрубочек, но в предыдущей работе мы сравнили динамику микротрубочек и актиновых нитей11.
Мы отмечаем, что эти репрезентативные результаты демонстрируют либо пассивную субдиффузию, либо активное баллистическое движение. Важно отметить, что DDM может быть использован для анализа систем, где есть кроссовер в типе динамики на промежуточных временных или длинных масштабах. В качестве примеров Kurzthaler et al. использовали DDM с системой активных коллоидов Януса для исследования активного направленного движения в коротких временных масштабах и рандомизации ориентации на более длинных временных масштабах59; Giavazzi et al. использовали DDM с огрубляющей пеной и обнаружили кроссовер в динамике, соответствующий шкале длины пузырька33; и Cho et al. использовали DDM с коллоидными гелями и обнаружили три различимых режима на разных масштабах длины, охватывающих от фрактальных кластеров до всей сети32.
Данные, включенные в раздел репрезентативных результатов, были получены с помощью микроскопии яркого поля и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии. Однако, как отмечалось ранее, DDM может использоваться со многими методами визуализации. При любом способе визуализации пользователи должны учитывать оптические настройки, такие как степень оптического сечения или глубина резкости. Высокая степень оптического сечения может уменьшить сигнал от объектов, находящихся вне фокуса, но нельзя будет точно измерить динамику во временных масштабах, превышающих временную шкалу для объектов, чтобы выйти из глубины резкости25,28. Более подробное обсуждение того, как q-зависимая глубина резкости влияет на DDM-анализ, можно найти в22. Для визуализации яркого поля пользователям также может потребоваться учитывать толщину образца. В то время как для образцов со слабым рассеянием более толстые образцы могут обеспечивать больший сигнал42, мутные образцы могут потребовать изменения анализа с учетом многократного рассеяния81. Наконец, для методов визуализации, которые не являются инвариантными линейного пространства (то есть, когда интенсивность, регистрируемая камерой объекта, зависит от того, где этот объект находится в плоскости выборки x-y), может потребоваться учитывать дисперсию линейного пространства, как показано в DDM27 темного поля.
Для тех, кто начинает работу с DDM, мы хотим подчеркнуть важность рассмотрения пространственного и временного разрешения. При проверке определенного времени затухания в зависимости от волнового числа важно отметить пределы своего разрешения (т. Е. Максимальное и минимальное время задержки и максимальное волновое число, как это сделано на рисунке 5). Следует тщательно продумать эти ограничения перед сбором данных, чтобы можно было выбрать оптимальный объектив, размер изображения, частоту кадров и продолжительность фильма. Другим важным соображением является то, как оценить фоновый параметр B. В литературе использовались многочисленные методы оценки фона, а последствия чрезмерного или недооценки В были описаны в предыдущих публикациях62,77. Как показано на рисунке 10, PyDDM позволяет пользователям реализовывать различные методы оценки B, и мы предлагаем новым пользователям попробовать эти методы и оценить, какие из них подходят для использования.
Сильной стороной этого пакета является его тщательная документация и пошаговые руководства с примерами данных, хранение и организация метаданных для отслеживания того, как выполнялся анализ, и гибкость в том, как анализировать матрицу DDM (различные модели подгонки, несколько методов оценки фонового параметра B, возможность найти MSD). Однако в этом коде есть несколько аспектов, которые можно улучшить. В настоящее время код не оптимизирован для быстрой скорости вычислений. Методов ускорения вычислений было сообщено61,62, и они будут реализованы в будущих выпусках. Кроме того, мы планируем внедрить недавно сообщенные методы для лучшей оценки неопределенностей и использовать моделирование для направления пользователей к соответствующей моделиISF 62. Для других улучшений мы надеемся, что пользователи свяжутся с нами с предложениями.
The authors have nothing to disclose.
Часть этого исследования была профинансирована премией R15 Национального института здравоохранения (National Institute of General Medical Sciences award No. R15GM123420, присужден R.M.R.-A. и R.J.M.), стипендия Коттрелла от Исследовательской корпорации по развитию науки (награда No 27459, присужденная R.J.M.) и исследовательский грант Фонда Уильяма М. Кека (присуждаемый R.M.R-A.). GHK с благодарностью выражает финансовую поддержку со стороны Голландского исследовательского совета (NWO; проект No VI.C.182.004 Программы талантов NWO).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |