Differentiell dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerar funktioner för dynamisk ljusspridning och mikroskopi. Här presenteras processen att använda DDM för att karakterisera rekonstituerade cytoskelettnätverk genom att kvantifiera den subdiffusiva och burade dynamiken hos partiklar i vimentinnätverk och den ballistiska rörelsen hos aktiva myosindrivna aktin-mikrotubulikompositer.
Celler kan krypa, självläka och ställa in sin styvhet på grund av deras anmärkningsvärt dynamiska cytoskelett. Som sådan kan rekonstituerande nätverk av cytoskelettala biopolymerer leda till en mängd aktiva och anpassningsbara material. Att konstruera sådana material med exakt avstämda egenskaper kräver emellertid att man mäter hur dynamiken beror på nätverkskompositionen och syntesmetoderna. Kvantifiering av sådan dynamik utmanas av variationer över tid, rum och formuleringsutrymme i sammansatta nätverk. Protokollet beskriver här hur Fourieranalystekniken, differentialdynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantifiera dynamiken i biopolymernätverk och är särskilt väl lämpad för studier av cytoskelettnätverk. DDM arbetar med tidssekvenser av bilder som förvärvats med hjälp av en rad mikroskopimetoder, inklusive laserskanningskonfokal, bredfältfluorescens och ljusfältsavbildning. Från sådana bildsekvenser kan man extrahera karakteristiska dekorrelationstider för densitetsfluktuationer över ett spann av vågvektorer. Ett användarvänligt Python-paket med öppen källkod för att utföra DDM-analys utvecklas också. Med detta paket kan man mäta dynamiken hos märkta cytoskelettkomponenter eller inbäddade spårpartiklar, vilket demonstreras här med data från mellanliggande filament (vimentin) nätverk och aktiva aktin-mikrotubulinätverk. Användare utan tidigare programmering eller bildbehandlingserfarenhet kommer att kunna utföra DDM med hjälp av detta programvarupaket och tillhörande dokumentation.
Cytoskeletten är ett nätverk av proteinfilament som sträcker sig över cytoplasman hos eukaryota celler och förbinder cellytan med kärnan. Den har unika materialegenskaper, vilket ger mekaniskt skydd mot stora och upprepade mekaniska belastningar, men driver också dynamiska cellformförändringar1. Rekonstituerade cytoskelettnätverk kan ge upphov till en rad intressanta dynamiska beteenden, från placering av inbäddade partiklar till ballistisk rörelse som drivs avmolekylära motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder för att analysera dynamiken i sådana nätverk inkluderar spårning av rörelsen hos inbäddade spårmikrosfärer 6,7,12,13,14, bildanalys för att spåra storleken på proteintäta kluster över tid8, dynamisk ljusspridning15, partikelbildvelocimetri 4,16,17,18,19 , beräkning av bildens effektspektrala densitet över tid19 och kymografanalys20. När fler studier om rekonstituerade cytoskelettnätverk genomförs, oavsett om man ska förstå cellulär mekanik eller aktiv materia, är robusta, opartiska och reproducerbara metoder för att karakterisera dynamiken alltmer nödvändiga. Differentiell dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknik som har använts för att studera cytoskelettdynamik, är en sådan teknik som effektivt kvantifierar dynamik med få användardefinierade parametrar. Med mjukvarupaketet som beskrivs här kommer forskare med liten erfarenhet av programmering eller bildanalys att kunna utnyttja DDM för sitt eget arbete.
DDM är en bildanalysteknik för att extrahera ett provs dynamik. Liksom partikelspårning eller partikelbildvelocimetri kräver DDM en tidsserie av bilder (ofta tusentals bilder), vanligtvis inspelade med ett mikroskop. Till skillnad från partikelspårning behöver enskilda funktioner eller spårpärlor inte lokaliseras (eller ens vara lokaliserade) i bilden. Till skillnad från både partikelspårning och partikelbildsvelocimetri återvinner man ensembledynamiken med DDM med relativt få användarspecificerade parametrar. Med DDM analyseras bilder i Fourierrummet för att bestämma sönderfallstiden för densitetsfluktuationer över ett antal vågnummer, q, där q = 2πu, och u är storleken på de rumsliga frekvenserna, . Man får spridningsliknande information men med verkliga rymdbilder som förvärvats på ett mikroskop 21,22,23. Därför kan man dra nytta av de olika kontrastgenererande metoderna för mikroskopi, såsom widefield fluorescens 22,24, konfokal fluorescens25, polariserad26, mörkfält27 eller ljus-ark fluorescens28 mikroskopier. Dessutom kan bilder som används för DDM-analys användas för partikelspårning eller partikelbildvelocimetri för att ge kompletterande information.
Denna kombination av funktioner från dynamisk ljusspridning och optisk mikroskopi gör DDM till en kraftfull och mångsidig teknik. Sedan den första beskrivningen av Cerbino och Trappe 200821, där DDM demonstrerades för att mäta diffusionen av 73 nm kolloidala partiklar, har DDM använts för att mäta flytande kolloider29, kolloidal aggregering30,31, viskoelasticiteten hos nematiska flytande kristaller26, dynamiken hos kolloidala geler32, grovskum33, nanopartiklar i begränsade miljöer34, 35,36,37, bakteriell motilitet 38,39,40,41, diffusion av svagt spridande proteinkluster42, kapillärvågor vid vätskegränssnitt43 och andra system. De som letar efter en mer fullständig lista över publikationer som använder DDM kan hänvisa till grundliga granskningsartiklar om ämnet 22,23,44,45.
DDM har också använts för att undersöka dynamiken i biologiska nätverk. använde DDM för att mäta dynamiken hos aktin i levande Drosophila-oocyter 46. kvantifierade dynamiken hos spårpartiklar i nätverk av hyaluronan och hyaluronan-kollagenkompositer47. Flera användningar av DDM för att studera dynamiken hos spårpartiklar i rekonstituerade cytoskelettnätverk 9,10, transport av DNA-molekyler i sådana nätverk 48,49 och dynamiken i aktiva rekonstituerade nätverk har också dokumenterats 11,50,51. En fördel med DDM vid mätning av dynamiken i sådana system är att enskilda partiklar eller molekyler inte behöver lokaliseras och spåras. Så till exempel kan dynamiken hos DNA-molekyler i trånga miljöer mätas med DDM trots svårigheten att spåra sådana små och icke-sfäriska molekyler. Vidare kan man med fluorescensmikroskopi använda flerfärgsmärkning för att selektivt mäta dynamiken hos enskilda beståndsdelar i en komplex komposit.
För att utföra DDM tas en sekvens av bilder över tiden, I(x,y,t). För en given fördröjningstid, Δt, hittas alla (eller en delmängd av) bildpar separerade av den fördröjningstiden. Den kvadratiska Fouriertransformen av skillnaden mellan varje par,
beräknas och beräknas i genomsnitt tillsammans. Denna kvantitet, , är radiellt medelvärde, förutsatt att dynamiken är isotrop. Detta ger DDM-matrisen (även kallad bildstrukturfunktionen),
. Denna process visas grafiskt i figur 1. För att bestämma provets dynamik från denna DDM-matris antas DDM-matrisen ha formen
där A är amplituden, som beror på mikroskopets detaljer och provets struktur, B är bakgrunden, som beror på bruset i bilderna, och f (q, Δt) är den mellanliggande spridningsfunktionen (ISF), som innehåller information om dynamiken21,22. I enkla fall,
där τ är en karakteristisk sönderfalls- eller dekorrelationstid. En sådan ISF har använts i flera studier som använder DDM på ergodiska system som utspädda kolloidala suspensioner 21,24,27,37,40,52. Andra former av ISF kan dock användas för att modellera olika typer av dynamik. Till exempel kan man använda en kumulantexpansion för att modellera ISF för polydispersprover som
där μ är ett mått på polydispersiteten42,53; om densitetsfluktuationer förfaller med två separata lägen kan man använda en ISF som
26, 54, 55, 56, 57;
andra isf-plattformar kan användas för att simma mikroorganismer eller andra aktiva partiklar 38,39,40,41,58,59.
Figur 1: Översikt över DDM-analys. Från tidsserien av bilder beräknas Fourier-transformen av bildskillnader för att beräkna DDM-matrisen. DDM-matrisen kan anpassas till en modell för att bestämma tidsskalan för densitetsfluktuationer över ett intervall av q-värden . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Här beskrivs användningen av ett DDM-analysprogramvarupaket utvecklat i Python, PyDDM. Detta programvarupaket bygger på det arbete som utförts av våra forskningslaboratorier och andra publicerade studier under de senaste åren. Primära motivatorer för att skapa detta programvarupaket inkluderar behovet av (1) att hålla reda på och lagra metadata och parametrar som används i analysen; (2) grundlig dokumentation med detaljerade exempel på analys från början till slut; och (3) ett enkelt sätt att använda olika (eller skapa nya) matematiska modeller för att passa data (t.ex. att lägga till ISF-modeller, som de som nyligen utvecklats för aktiva filament60, skulle vara enkelt). Andra programvarupaket för DDM-analys finns också, men inte alla är väl dokumenterade och skrivna i ett programmeringsspråk med öppen källkod. Det finns till exempel C ++ -kod med databehandling på GPU: er (https://github.com/peterlu/ConDDM) 25, C ++ -kod som använder Fourier-transformeringar i tid för att påskynda beräkningar (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro) 61, MATLAB- och Python-versioner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM) 40, MATLAB-kod (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html) 27 och MATLAB-kod med osäkerhetskvantifiering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Eftersom detta PyDDM-paket är väldokumenterat och ger mycket flexibilitet i hur DDM-matrisen beräknas och analyseras, kan det förhoppningsvis vara användbart för forskare som vill implementera DDM oavsett bakgrund i programmering eller bildanalys.
Protokollet visar hur detta mjukvarupaket kan användas för att kvantifiera dynamiken i in vitro-rekonstituerade cytoskelettnätverk. Detta görs genom att använda två distinkta uppsättningar bilddata: (1) bilder av submikronspårämnespartiklar inbäddade i ett vimentinnätverk tagna med brightfield-mikroskopi och (2) bilder av fluorescerande märkta aktin- och mikrotubulifilament i ett intrasslat kompositnätverk med myosindriven aktivitet tagen med laserscannande konfokalmikroskopi. Analyserna av dessa två dataset belyser anmärkningsvärda styrkor hos DDM, inklusive dess förmåga att analysera bilder tagna med en mängd olika bildmetoder (t.ex. ljusfält eller konfokal fluorescens), att extrahera dynamik från antingen inbäddade spårämnen eller från märkta filament och att kvantifiera en mängd olika dynamiker (t.ex. subdiffusiv och begränsad eller ballistisk).
Programvarupaketet som beskrivs här använder DDM för att analysera densitetsfluktuationer som observerats i bilder som förvärvats med hjälp av ett optiskt mikroskop. Representativa resultat från data från spårpartiklar inbäddade i vimentinnätverk visades först. Analysen av sådana data kan användas för att karakterisera nätets maskstorlek och styvhet på samma sätt som enpartikelspårning har använts i många tidigare studier av cytoskelettnätverk 6,12,13. En fördel med att använda DDM jämfört med enpartikelspårning är att DDM inte kräver att partiklarna lokaliseras. Därför, även i bilder där partikeldensiteten är för hög eller partiklarna för små för att lokalisera och spåra, kan DDM fortfarande bestämma dynamiken. Där spårning av en partikel skulle vara fördelaktigt är vid inspektion av partikel-till-partikel-variabilitet. Med DDM finner man ensemblens genomsnittliga dynamik medan man med enpartikelspårning kan beräkna både en enda partikels MSD och ensemble-medelvärdet MSD. DDM kan dock användas för att undersöka heterogen dynamik genom att analysera flera regioner av intresse inom ett stort synfält.
Därefter visades representativa resultat från data av fluorescerande märkta filament i ett aktivt nätverk bestående av två olika märkta cytoskelettfilamenttyper11. Med dessa data karakteriserades den ballistiska rörelsen utan att behöva några lokaliserbara funktioner i bilden. Eftersom DDM extraherar ensemblens genomsnittliga dynamik med få användaringångar, gör det enkelt att jämföra bildserier som förvärvats med olika förhållanden (t.ex. att jämföra prover med olika förhållanden mellan aktin och mikrotubuli eller prover med olika koncentrationer av myosin, som gjorts i50). Med hjälp av fluorescerande avbildning kan vi dessutom undersöka dynamiken hos olika komponenter i ett nätverk med hjälp av flerfärgad märkning. Detta gjordes i11,50, där dynamiken hos aktin och mikrotubuli analyserades separat i ett aktivt aktin-mikrotubulikompositnätverk med hjälp av flerfärgad avbildning. I avsnittet om representativa resultat här visades bara resultaten från mikrotubulikanalen, men i tidigare arbete jämförde vi dynamiken hos mikrotubuli och aktinfilament11.
Vi noterar att dessa representativa resultat visar antingen passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk rörelse. Viktigt är att DDM kan användas för att analysera system där det finns en crossover i typen av dynamik vid mellanliggande tids- eller längdskalor. använde DDM med ett system av aktiva Janus-kolloider för att utforska aktiv riktad rörelse vid korta tidsskalor och randomisering av orienteringen vid längre tidsskalor59; använde DDM med ett grovskum och fann en korsning i dynamiken som motsvarar längdskalan för en bubbla33; använde DDM med kolloidala geler och fann tre urskiljbara regimer i olika längdskalor som sträckte sig från fraktalklusterna till hela nätverket32.
De data som ingår i avsnittet om representativa resultat förvärvades med brightfield-mikroskopi och laserscannande konfokalmikroskopi. Men som tidigare nämnts kan DDM användas med många bildmetoder. Med vilken bildmodalitet som helst bör användare överväga optiska inställningar som graden av optisk sektionering eller skärpedjupet. En hög grad av optisk sektionering kan minska signalen från objekt som inte är i fokus, men man kommer inte att kunna mäta dynamiken exakt över tidsskalor som är större än tidsskalan för objekt att röra sig ur skärpedjupet25,28. En mer grundlig diskussion om hur det q-beroende skärpedjupet påverkar DDM-analysen finns i22. För ljusfältsavbildning kan användare också behöva överväga provtjockleken. Medan för svagt spridda prover kan tjockare prover ge mer signal42, kan grumliga prover kräva att analysen modifieras för att ta hänsyn till multipel spridning81. Slutligen, för avbildningsmetoder som inte är linjära rymdinvarianta (det vill säga där intensiteten som registreras av kameran på ett objekt beror på var objektet befinner sig i x-y-provplanet), kan man behöva ta hänsyn till den linjära rymdvariansen, vilket demonstreras med DDM27 med mörkt fält.
För dem som kommer igång med DDM vill vi betona vikten av att överväga den rumsliga och tidsmässiga upplösningen. När man inspekterar de bestämda sönderfallstiderna som en funktion av vågnumret är det viktigt att markera gränserna för sin upplösning (dvs. de maximala och minsta fördröjningstiderna och det maximala vågnumret, som görs i figur 5). Man bör tänka noga över dessa gränser innan man samlar in data så att den optimala objektivlinsen, bildstorleken, bildhastigheten och filmens varaktighet kan väljas. Det andra viktiga övervägandet är hur man uppskattar bakgrundsparametern B. Flera metoder för att skatta bakgrunden har använts i litteraturen, och effekterna av över- eller underskattning av B har beskrivits i tidigare publikationer62,77. Som visas i figur 10 tillåter PyDDM användare att implementera olika metoder för att uppskatta B, och vi föreslår att nya användare provar dessa metoder och utvärderar vilka som är lämpliga att använda.
En styrka med detta paket är dess grundliga dokumentation och genomgångar med exempeldata, lagring och organisering av metadata för att hålla reda på hur analyser utfördes och flexibiliteten i hur man analyserar DDM-matrisen (olika anpassningsmodeller, flera metoder för att uppskatta bakgrundsparametern B, möjligheten att hitta MSD). Det finns dock flera aspekter av den här koden som kan förbättras. För närvarande har koden inte optimerats för snabb beräkningshastighet. Metoder för att snabba upp beräkningen har rapporterats61,62, och dessa kommer att implementeras i framtida utgåvor. Dessutom planerar vi att implementera nyligen rapporterade metoder för att bättre uppskatta osäkerheter och att använda simuleringar för att vägleda användare till lämplig ISF-modell62. För andra förbättringar hoppas vi att användare kommer att kontakta oss med förslag.
The authors have nothing to disclose.
Delar av denna forskning finansierades av ett National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award nr. R15GM123420, tilldelas R.M.R.-A. och R.J.M.), ett Cottrell Scholar Award från Research Corporation for Science Advancement (pris nr 27459, tilldelat R.J.M.) och ett William M. Keck Foundation Research Grant (tilldelat R.M.R-A.). GHK erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från det nederländska forskningsrådet (NWO; projektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Programme).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |