Isolering og identifikation af vandbårne antibiotikaresistente bakterier og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener
Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering og identifikation af antibiotikaresistente bakterier fra vand og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener (ARG’er). Brugen af kulturbaserede og ikke-kulturbaserede (metagenomiske analyser) teknikker giver fuldstændig information om den samlede bakterielle mangfoldighed og den samlede pulje af forskellige ARG’er, der findes i ferskvand fra Mumbai, Indien.
Abstract
Udviklingen og spredningen af antibiotikaresistens (AR) gennem mikrobiota forbundet med ferskvandsområder er et stort globalt sundhedsproblem. I denne undersøgelse blev ferskvandsprøver indsamlet og analyseret med hensyn til den samlede bakterielle mangfoldighed og AR-gener (ARG’er) ved hjælp af både konventionelle kulturbaserede teknikker og en kulturuafhængig metagenomisk tilgang med høj kapacitet. Dette papir præsenterer en systematisk protokol til tælling af de samlede og antibiotikaresistente dyrkelige bakterier fra ferskvandsprøver og bestemmelse af fænotypisk og genotypisk resistens i de dyrkelige isolater. Desuden rapporterer vi brugen af hel metagenomisk analyse af det samlede metagenomiske DNA ekstraheret fra ferskvandsprøven til identifikation af den samlede bakterielle mangfoldighed, herunder ikke-dyrkelige bakterier, og identifikation af den samlede pulje af forskellige ARG’er (resistome) i vandlegemet. Efter disse detaljerede protokoller observerede vi en høj antibiotikaresistent bakteriebelastning i området 9,6 × 10 5-1,2 × 10 9 CFU / ml. De fleste isolater var resistente over for de mange testede antibiotika, herunder cefotaxim, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxon, gentamicin, neomycin, trimethoprim og ciprofloxacin, med multiple antibiotikaresistensindekser (MAR) på ≥0,2, hvilket indikerer høje resistensniveauer i isolaterne. 16S rRNA-sekventeringen identificerede potentielle humane patogener, såsom Klebsiella pneumoniae, og opportunistiske bakterier, såsom Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. og Aeromonas spp. Den molekylære karakterisering af isolaterne viste tilstedeværelsen af forskellige ARG’er, såsom blaTEM, blaCTX-M (β-lactamer), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglycosider) og dfr1 (trimethoprims), hvilket også blev bekræftet af hele metagenomisk DNA-analyse. En høj forekomst af andre ARG’er, der koder for antibiotikaudstrømningspumper-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamaser-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, chloramphenicolacetyltransferase-genet catB10 og rifampicinresistensgenet rphB-blev også påvist i det metagenomiske DNA. Ved hjælp af protokollerne diskuteret i denne undersøgelse bekræftede vi tilstedeværelsen af vandbårne MAR-bakterier med forskellige AR-fænotypiske og genotypiske træk. Således kan hel metagenomisk DNA-analyse bruges som en komplementær teknik til konventionelle kulturbaserede teknikker til at bestemme den samlede AR-status for et vandlegeme.
Introduction
Antimikrobiel resistens (AMR) er blevet identificeret som et af de mest presserende globale problemer. Den hurtige udvikling af antimikrobiel resistens og dens verdensomspændende udbredelse er en af de største trusler mod menneskers sundhed og den globale økonomi med hensyn til de sundhedsomkostninger, der er forbundet hermed1. Overforbrug og misbrug af antibiotika har ført til en stigning i AR. Dette er blevet fremhævet af COVID-19-pandemien, hvor behandlingen af tilknyttede sekundære infektioner i mange tilfælde blev enormt kompromitteret på grund af AMR hos de berørte patienter2. Ud over menneskers direkte brug/misbrug af antibiotika giver overforbrug og misbrug af antibiotika i landbrug og husdyrhold og deres uhensigtsmæssige udledning i miljøet, herunder vandområder, anledning til stor bekymring3. Stigningen i nye resistensegenskaber og multiresistens i bakterier understreger presserende behovet for en bedre forståelse af de faktorer, der fører til udviklingen af AR og dens udbredelse. Flere antibiotikaresistente bakterier, som ofte bærer flere AR-gener (ARG’er) på mobile genetiske elementer såsom plasmider, kan overføre disse resistensgener til ikke-resistente mikroorganismer, herunder potentielle humane patogener, hvilket fører til fremkomsten af superbugs, der ikke kan behandles med selv antibiotika i sidste udvej4. Disse flere antibiotikaresistente bakterier, hvis de findes i vandøkosystemer, kan direkte komme ind i den menneskelige tarm via forbruget af forurenede vandbaserede fødevarer som fisk, krabber og bløddyr. Tidligere undersøgelser har vist, at spredningen af AR-bakterier i naturligt forekommende vandsystemer også kan nå andre vandforsyninger, herunder drikkevand, og dermed kan komme ind i den menneskelige fødekæde 5,6,7.
Formålet med denne undersøgelse er at tilvejebringe en omfattende protokol ved hjælp af en kombination af kulturbaserede og ikke-kulturbaserede (hele metagenomiske analyser) teknikker til at opnå fuldstændig information om den samlede bakterielle mangfoldighed og den samlede pulje af forskellige ARG’er, der findes i et vandområde i Mumbai, Indien. Konventionelt er kulturbaserede teknikker blevet brugt til at studere bakteriel mangfoldighed i vandområder. Da dyrkelige mikroorganismer kun udgør en lille procentdel af den samlede mikrobiota i enhver niche, skal forskellige kulturbaserede og kulturuafhængige teknikker anvendes sammen for at få en bedre forståelse af den overordnede status for bakteriel mangfoldighed og de forskellige resistente træk, der er fremherskende i enhver prøve. En sådan robust og pålidelig kulturuafhængig teknik er hel metagenomisk DNA-analyse. Denne high-throughput metode er blevet anvendt med succes i forskellige undersøgelser af bakteriel mangfoldighed eller de funktionelle annoteringer af forskellige ARGs 8,9. Denne teknik bruger metagenomet (det samlede genetiske materiale i en prøve) som udgangsmateriale til forskellige analyser og er derfor dyrkningsuafhængig. Protokollerne i denne undersøgelse kan bruges til hel metagenomisk DNA-analyse for at få information om den samlede bakterielle mangfoldighed og forskellige ARG’er (resistomer) i vandprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prøveindsamling og -behandling spiller en væsentlig rolle og kan påvirke resultaterne og fortolkningen af undersøgelsen. For at udelukke variationen i prøverne er det derfor vigtigt at foretage prøveudtagning flere steder i det ferskvandsområde, der undersøges. Opretholdelse af korrekte aseptiske miljøforhold ved håndtering af sådanne prøver kan forhindre kontaminering. For at undgå ændringer i bakteriesammensætningen, som kan påvirke kvaliteten og mængden af ekstraherede nukleinsyrer, bør transitbeting…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af finansielle tilskud fra Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme ved University of Mumbai. Devika Ghadigaonkar arbejdede som Project Fellow under ordningen. Den tekniske hjælp fra Harshali Shinde, seniorforsker under Institut for Naturvidenskab og Teknologi-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projekt nr.: CRG/2018/003624, anerkendes.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
