Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus Wasser und die molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene (ARGs) vor. Die Verwendung von kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (metagenomischen Analysen) Techniken liefert vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs, die in Süßgewässern aus Mumbai, Indien, vorhanden sind.
Abstract
Die Entwicklung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen (AR) durch Mikrobiota in Verbindung mit Süßwasserkörpern ist ein großes globales Gesundheitsproblem. In der vorliegenden Studie wurden Süßwasserproben gesammelt und in Bezug auf die gesamte bakterielle Diversität und AR-Gene (ARGs) analysiert, wobei sowohl konventionelle kulturbasierte Techniken als auch ein kulturunabhängiger metagenomischer Ansatz mit hohem Durchsatz verwendet wurden. Dieser Artikel stellt ein systematisches Protokoll für die Zählung der gesamten und antibiotikaresistenten kultivierbaren Bakterien aus Süßwasserproben und die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Resistenz in den kultivierbaren Isolaten vor. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung der gesamten metagenomischen Analyse der gesamten metagenomischen DNA, die aus der Süßwasserprobe extrahiert wurde, zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Vielfalt, einschließlich nicht kultivierbarer Bakterien, und zur Identifizierung des gesamten Pools verschiedener ARGs (Resistome) im Gewässer. Nach diesen detaillierten Protokollen beobachteten wir eine hohe Antibiotika-resistente Bakterienlast im Bereich von 9,6 × 10 5-1,2 × 109 KBE/ml. Die meisten Isolate waren resistent gegen die mehrfach getesteten Antibiotika, darunter Cefotaxim, Ampicillin, Levofloxacin, Chloramphenicol, Ceftriaxon, Gentamicin, Neomycin, Trimethoprim und Ciprofloxacin, mit multiplen Antibiotikaresistenzindizes (MAR) von ≥0,2, was auf eine hohe Resistenz der Isolate hinweist. Die 16S-rRNA-Sequenzierung identifizierte potenzielle humanpathogene wie Klebsiella pneumoniae und opportunistische Bakterien wie Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. und Aeromonas spp. Die molekulare Charakterisierung der Isolate zeigte das Vorhandensein verschiedener ARGs, wie blaTEM, blaCTX-M (β-Lactame), aadA, aac (6′)-Ib (Aminoglykoside) und dfr1 (Trimethoprims), was auch durch die gesamte metagenomische DNA-Analyse bestätigt wurde. Eine hohe Prävalenz anderer ARGs, die für antibiotische Ausflusspumpen kodieren – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-Lactamasen-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen catB10 und das Rifampicin-Resistenzgen rphB- wurde ebenfalls in der metagenomischen DNA nachgewiesen. Mit Hilfe der in dieser Studie diskutierten Protokolle bestätigten wir das Vorhandensein von wasserbürtigen MAR-Bakterien mit verschiedenen phänotypischen und genotypischen Merkmalen von AR. Daher kann die gesamte metagenomische DNA-Analyse als komplementäre Technik zu herkömmlichen kulturbasierten Techniken verwendet werden, um den gesamten AR-Status eines Gewässers zu bestimmen.
Introduction
Antimikrobielle Resistenzen (AMR) wurden als eines der drängendsten globalen Probleme identifiziert. Die rasche Entwicklung antimikrobieller Resistenzen und ihre weltweite Ausbreitung sind eine der größten Bedrohungen für die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft in Bezug auf die damit verbundenen Gesundheitskosten1. Der übermäßige Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika haben zu einer Zunahme von AR geführt. Dies wurde durch die COVID-19-Pandemie unterstrichen, bei der die Behandlung von assoziierten Sekundärinfektionen in vielen Fällen aufgrund von AMR bei den betroffenen Patienten stark beeinträchtigt war2. Neben der direkten Verwendung/dem Missbrauch von Antibiotika durch den Menschen sind der übermäßige Einsatz und Missbrauch von Antibiotika in der Landwirtschaft und Tierhaltung und ihre unsachgemäße Einleitung in die Umwelt, einschließlich der Gewässer, eingroßes Problem 3. Das Aufkommen neuer Resistenzmerkmale und Multiresistenzen bei Bakterien unterstreicht dringend die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der Faktoren, die zur Entwicklung von AR und ihrer Verbreitung führen. Mehrere antibiotikaresistente Bakterien, die oft mehrere AR-Gene (ARGs) auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden tragen, können diese Resistenzgene auf nicht-resistente Mikroorganismen, einschließlich potenzieller humaner Krankheitserreger, übertragen, was zur Entstehung von Superbugs führt, die selbst mit Antibiotika als letztes Mittel nicht behandelbar sind4. Diese multiplen antibiotikaresistenten Bakterien können, wenn sie in Wasserökosystemen vorkommen, direkt über den Verzehr von kontaminierten wasserbasierten Lebensmitteln wie Fischen, Krabben und Weichtieren in den menschlichen Darm gelangen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Ausbreitung von AR-Bakterien in natürlich vorkommenden Wassersystemen auch andere Wasservorräte, einschließlich Trinkwasser, erreichen und so in die menschliche Nahrungskette gelangen kann 5,6,7.
Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, ein umfassendes Protokoll zu erstellen, das eine Kombination aus kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (gesamte metagenomische Analyse) Techniken verwendet, um vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs in einem Gewässer in Mumbai, Indien, zu erhalten. Herkömmlicherweise wurden kulturbasierte Techniken verwendet, um die bakterielle Vielfalt in Gewässern zu untersuchen. Da kultivierbare Mikroorganismen nur einen kleinen Prozentsatz der gesamten Mikrobiota in jeder Nische ausmachen, müssen verschiedene kulturbasierte und kulturunabhängige Techniken gleichzeitig eingesetzt werden, um den Gesamtstatus der bakteriellen Vielfalt und die verschiedenen Resistenzmerkmale in jeder Probe besser zu verstehen. Eine solche robuste und zuverlässige kulturunabhängige Technik ist die gesamte metagenomische DNA-Analyse. Diese Hochdurchsatzmethode wurde erfolgreich in verschiedenen Studien zur bakteriellen Diversität oder den funktionellen Annotationen verschiedener ARGs 8,9 eingesetzt. Diese Technik nutzt das Metagenom (das gesamte Erbgut einer Probe) als Ausgangsmaterial für verschiedene Analysen und ist somit kulturunabhängig. Die Protokolle in der vorliegenden Studie können für die gesamte metagenomische DNA-Analyse verwendet werden, um Informationen über die gesamte bakterielle Diversität und verschiedene ARGs (Resistome) in Wasserproben zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Probenentnahme und -verarbeitung spielt eine wichtige Rolle und kann die Ergebnisse und die Interpretation der Studie beeinflussen. Um eine Variabilität der Proben auszuschließen, ist es daher wichtig, die Probenahme an mehreren Stellen des untersuchten Süßwasserkörpers durchzuführen. Die Aufrechterhaltung geeigneter aseptischer Umgebungsbedingungen bei der Handhabung solcher Proben kann eine Kontamination verhindern. Um Veränderungen in der Bakterienzusammensetzung zu vermeiden, die die Qualität und Quantit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch finanzielle Zuschüsse des Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme der University of Mumbai unterstützt. Devika Ghadigaonkar arbeitete als Projektstipendiatin im Rahmen des Programms. Die technische Hilfe von Harshali Shinde, Senior Research Fellow unter der Projektnummer CRG/2018/003624 des Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB), wird gewürdigt.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
