Isolering og identifisering av vannbårne antibiotikaresistente bakterier og molekylær karakterisering av deres antibiotikaresistensgener
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for isolering og identifisering av antibiotikaresistente bakterier fra vann og molekylær karakterisering av deres antibiotikaresistensgener (ARGs). Bruken av kulturbaserte og ikke-kulturbaserte (metagenomiske analyser) teknikker gir fullstendig informasjon om det totale bakterielle mangfoldet og det totale bassenget av forskjellige ARG-er som finnes i ferskvann fra Mumbai, India.
Abstract
Utviklingen og spredningen av antibiotikaresistens (AR) gjennom mikrobiota assosiert med ferskvannsforekomster er et stort globalt helseproblem. I denne studien ble ferskvannsprøver samlet inn og analysert med hensyn til det totale bakteriemangfoldet og AR-gener (ARG) ved hjelp av både konvensjonelle kulturbaserte teknikker og en kulturuavhengig metagenomisk tilnærming med høy gjennomstrømning. Denne artikkelen presenterer en systematisk protokoll for oppregning av de totale og antibiotikaresistente dyrkbare bakteriene fra ferskvannsprøver og bestemmelse av fenotypisk og genotypisk resistens i de dyrkbare isolatene. Videre rapporterer vi bruken av hele metagenomisk analyse av det totale metagenomiske DNA ekstrahert fra ferskvannsprøven for identifisering av det totale bakterielle mangfoldet, inkludert ikke-dyrkbare bakterier, og identifisering av det totale bassenget av forskjellige ARG-er (resistom) i vannkroppen. Etter disse detaljerte protokollene observerte vi en høy antibiotikaresistent bakteriebelastning i området 9,6 × 10 5-1,2 × 10 9 CFU/ml. De fleste isolatene var resistente mot de mange testede antibiotika, inkludert cefotaksim, ampicillin, levofloksacin, kloramfenikol, ceftriaxon, gentamicin, neomycin, trimetoprim og ciprofloxacin, med flere antibiotikaresistensindekser (MAR) på ≥0,2, noe som indikerer høye nivåer av resistens i isolatene. 16S rRNA-sekvenseringen identifiserte potensielle humane patogener, som Klebsiella pneumoniae, og opportunistiske bakterier, som Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., og Aeromonas spp. Den molekylære karakteriseringen av isolatene viste tilstedeværelsen av forskjellige ARG-er, som blaTEM, blaCTX-M (β-laktamer), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglykosider) og dfr1 (trimetoprimer), som også ble bekreftet av hele metagenomisk DNA-analyse. En høy forekomst av andre ARG-er som koder for antibiotiske efflukspumper-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaser-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol acetyltransferase-genet catB10 og rifampicinresistensgenet rphB-ble også påvist i metagenomisk DNA. Ved hjelp av protokollene som ble diskutert i denne studien, bekreftet vi tilstedeværelsen av vannbårne MAR-bakterier med forskjellige AR-fenotypiske og genotypiske egenskaper. Dermed kan hele metagenomisk DNA-analyse brukes som en komplementær teknikk til konvensjonelle kulturbaserte teknikker for å bestemme den generelle AR-statusen til en vannkropp.
Introduction
Antimikrobiell resistens (AMR) har blitt identifisert som et av de mest presserende globale problemene. Den raske utviklingen av AMR og dens verdensomspennende spredning er en av de største truslene mot menneskers helse og den globale økonomien når det gjelder helsekostnadene forbundet med den1. Overforbruk og misbruk av antibiotika har ført til en økning i AR. Dette har blitt fremhevet av COVID-19-pandemien, der behandlingen av tilknyttede sekundære infeksjoner i mange tilfeller ble enormt kompromittert på grunn av AMR hos de berørte pasientene2. Foruten direkte bruk / misbruk av antibiotika av mennesker, er overforbruk og misbruk av antibiotika i landbruk og husdyrhold og deres upassende utslipp i miljøet, inkludert vannforekomster, en stor bekymring3. Fremveksten av nye resistensegenskaper og multiresistens hos bakterier understreker behovet for en bedre forståelse av faktorene som fører til utvikling av AR og spredning av disse. Flere antibiotikaresistente bakterier, som ofte bærer flere AR-gener (ARG) på mobile genetiske elementer som plasmider, kan overføre disse resistensgenene til ikke-resistente mikroorganismer, inkludert potensielle humane patogener, og dermed føre til fremveksten av superbugs som ikke kan behandles med selv siste utvei antibiotika4. Disse flere antibiotikaresistente bakteriene, hvis de finnes i vannøkosystemer, kan direkte komme inn i menneskets tarm via forbruk av forurensede vannbaserte matvarer som fisk, krabber og bløtdyr. Tidligere studier har vist at spredningen av AR-bakterier i naturlig forekommende vannsystemer også kan nå andre vannforsyninger, inkludert drikkevann, og dermed kan komme inn i den menneskelige næringskjeden 5,6,7.
Målet med denne studien er å gi en omfattende protokoll ved hjelp av en kombinasjon av kulturbaserte og ikke-kulturbaserte (hele metagenomiske analyser) teknikker for å oppnå fullstendig informasjon om det totale bakterielle mangfoldet og det totale bassenget av forskjellige ARG-er som er tilstede i en vannkropp i Mumbai, India. Konvensjonelt har kulturbaserte teknikker blitt brukt til å studere bakteriemangfoldet i vannforekomster. Siden dyrkbare mikroorganismer bare utgjør en liten prosentandel av den totale mikrobiotaen i en hvilken som helst nisje, for å få en bedre forståelse av den generelle statusen for bakteriemangfold og de forskjellige resistente egenskapene som er utbredt i en prøve, må forskjellige kulturbaserte og kulturuavhengige teknikker brukes i tandem. En slik robust og pålitelig kulturuavhengig teknikk er hele metagenomisk DNA-analyse. Denne metoden med høy gjennomstrømning har blitt brukt med suksess i ulike studier av bakteriemangfold eller funksjonelle merknader fra forskjellige ARGs 8,9. Denne teknikken bruker metagenomet (det totale genetiske materialet i en prøve) som utgangsmateriale for ulike analyser og er derfor kulturuavhengig. Protokollene i denne studien kan brukes til fullmetagenomisk DNA-analyse for å få informasjon om det totale bakteriemangfoldet og ulike ARG-er (resistom) i vannprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prøveinnsamlingen og behandlingen spiller en betydelig rolle og kan påvirke resultatene og tolkningen av studien. For å utelukke variasjon i prøvene er det derfor viktig å utføre prøvetaking på flere steder i ferskvannskroppen som studeres. Å opprettholde riktige aseptiske miljøforhold ved håndtering av slike prøver kan forhindre forurensning. Videre, for å forhindre endringer i bakteriesammensetningen som kan påvirke kvaliteten og mengden av ekstraherte nukleinsyrer, bør transittbetingelsene opprettholdes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av økonomiske tilskudd fra Institutt for vitenskap og teknologi-fremme av universitetsforskning og vitenskapelig fortreffelighet (DST-PURSE) Scheme ved University of Mumbai. Devika Ghadigaonkar jobbet som prosjektstipendiat under ordningen. Den tekniske hjelpen fra Harshali Shinde, seniorforsker under Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Prosjektnr: CRG/2018/003624, er anerkjent.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
