Visualizzazione delle caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare nel muscolo gastrocnemio mediale di ratto
Summary
Il protocollo mostra un metodo per esaminare la correlazione spaziale tra i terminali pre-sinaptici, i recettori post-sinaptici e le cellule di Schwann peri-sinaptiche nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto utilizzando immunoistochimica fluorescente con diversi biomarcatori, vale a dire, neurofilamento 200, trasportatore vescicolare dell’acetilcolina, alfa-bungarotossina e S100.
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è una struttura complessa che serve per la comunicazione del segnale dal motoneurone al muscolo scheletrico ed è costituita da tre componenti istologiche essenziali: i terminali dell’assone motorio pre-sinaptico, i recettori nicotinici post-sinaptici dell’acetilcolina (AchRs) e le cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC). Al fine di dimostrare le caratteristiche morfologiche di NMJ, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio ed esaminato utilizzando colorazioni fluorescenti multiple con vari tipi di biomarcatori, tra cui neurofilamento 200 (NF200) e trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) per le fibre nervose motorie e i loro terminali pre-sinaptici, alfa-bungarotossina (α-BTX) per gli AchR nicotinici post-sinaptici, e S100 per gli sportelli unici. In questo studio, la colorazione è stata eseguita in due gruppi: nel primo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, VAChT e α-BTX, e nel secondo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, α-BTX e S100. È stato dimostrato che entrambi i protocolli possono dimostrare efficacemente la struttura dettagliata di NMJ. Utilizzando il microscopio confocale, sono state osservate le caratteristiche morfologiche dei terminali pre-sinaptici, dei recettori post-sinaptici e del PSC e le loro immagini Z-stacks sono state ricostruite in un modello tridimensionale per analizzare ulteriormente la correlazione spaziale tra le diverse etichette. Dal punto di vista metodologico, questi protocolli forniscono un valido riferimento per indagare le caratteristiche morfologiche della NMJ in condizioni fisiologiche, che possono essere idonee anche a valutare l’alterazione patologica della NMJ, come la lesione e la rigenerazione del nervo periferico.
Introduction
Come tre componenti strutturali essenziali della giunzione neuromuscolare (NMJ)1,2,3,4, gli aspetti morfologici dei terminali dell’assone motorio pre-sinaptico, della membrana post-sinaptica contenente recettori nicotinici dell’acetilcolina (AchR) e delle cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC) sono stati ampiamente studiati. Sezioni sottili e campioni interi dei muscoli scheletrici sono stati esaminati con diverse tecniche istologiche, come la microscopia elettronica 5,6, la microscopia confocale 7,8 e la microscopia a foglio luminoso 9,10. Sebbene le caratteristiche morfologiche di NMJ siano state dimostrate da queste tecniche da diversi aspetti, come confronto, la microscopia confocale è ancora una scelta ideale per l’imaging della morfologia dettagliata di NMJ.
Recentemente, sono state sviluppate molte nuove tecnologie per mostrare i componenti strutturali di NMJ. Ad esempio, i topi fluorescenti transgenici thy1-YFP sono stati utilizzati direttamente per osservare gli assoni motori e le piastre terminali del motore in vivo e in vitro10,11. Inoltre, l’iniezione endovenosa di α-BTX fluorescente è stata applicata per rivelare la distribuzione spaziale delle piastre terminali motorie nei muscoli scheletrici a montaggio intero di topi fluorescenti wild-type e transgenici, utilizzando il trattamento di compensazione ottica dei tessuti per l’esame con microscopia a foglio luminoso 9,12. Tuttavia, a parte gli elementi pre e post-sinaptici che possono essere visualizzati con questi metodi avanzati, i PSC non possono essere dimostrati allo stesso tempo.
L’accumulo di prove indica che le PSC, come le cellule gliali periferiche, sono strettamente associate ai terminali pre-sinaptici che contribuiscono allo sviluppo e alla stabilità della NMJ, alla modulazione dell’attività sinaptica della NMJ nella condizione fisiologica e alla rigenerazione della NMJ dopo la lesione nervosa 13,14,15 . Considerando l’architettura cellulare di NMJ, questo protocollo è un candidato appropriato per etichettare contemporaneamente le PSC, gli elementi pre e post-sinaptici, ed è potenzialmente utilizzato per valutare l’integrità e la plasticità del NMJ in condizioni normali e patologiche. Ad esempio, confrontare l’intensità di NMJ, la morfologia e il volume delle placche motorie post-sinaptiche, l’innervazione e la denervazione di NMJ e il numero di PSC nei muscoli di stato fisiologico e patologico.
Il muscolo gastrocnemio è il muscolo più grande che forma il rigonfiamento nel polpaccio, che viene facilmente sezionato rimuovendo la pelle e il muscolo bicipite femorale dall’arto. Il muscolo viene spesso scelto per valutare l’atrofia muscolare, la degenerazione neuromuscolare, le prestazioni muscolari e la forza dell’unità motoria ex vivo o in vivo 16,17,18. Tuttavia, la tecnica è adatta anche per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ da vari muscoli scheletrici. Allo stesso tempo, le sezioni muscolari spesse possono rivelare una morfologia e una quantità più complete di NMJ rispetto alle sezioni sottili 7,8 e alle fibre muscolari stuzzicate19.
In linea con questi studi, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio in questo studio ed è stato affettato ad uno spessore di 80 μm per la colorazione fluorescente multipla con vari tipi di biomarcatori in base ai componenti strutturali di NMJ. Qui, neurofilamento 200 (NF200) 20,21, trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) 22, alfa-bungarotossina (α-BTX) 23,24 e S10025,26 sono stati utilizzati per etichettare rispettivamente fibre nervose, terminali pre-sinaptici, AchR post-sinaptici e PSC. Inoltre, lo sfondo del tessuto muscolare e dei nuclei cellulari è stato ulteriormente controinziato con falloidina e DAPI.
In questo studio, ci aspettiamo di sviluppare un protocollo raffinato per colorare simultaneamente l’architettura cellulare di NMJ con i loro corrispondenti biomarcatori su campioni fissi più spessi, che è più conveniente per l’uso in microscopia confocale e aiuta a ottenere molte più informazioni sulla struttura dettagliata delle PSC, sugli elementi pre e post-sinaptici, nonché sulla loro correlazione spaziale tra loro. Dal punto di vista della metodologia, questo protocollo può trarre beneficio per valutare le caratteristiche morfologiche di NMJ in condizioni normali e patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per eseguire con successo la colorazione multipla di fette muscolari e l’uso di immunoistochimica fluorescente per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ sulle sezioni spesse del muscolo gastrocnemio mediale di ratto. Utilizzando questo approccio, i dettagli fini e la correlazione spaziale delle PSC e degli elementi pre e post-sinaptici possono essere analizzati e apprezzati sotto microscopia confocale e ulteriormente ricostruiti in un modello tridimensionale. Qui, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal CACMS Innovation Fund (No. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (n. 82004299) e i fondi di ricerca fondamentale per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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