Summary

הדגמה של יישור הרצף לחיזוי בין מינים כלי רגישות להערכה מהירה של שימור חלבונים

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בגרסה העדכנית ביותר של יישור הרצף של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה”ב כדי לחזות רגישות בין מינים (SeqAPASS) כלי. פרוטוקול זה מדגים את היישום של הכלי המקוון לניתוח מהיר של שימור חלבונים ולספק תחזיות הניתנות להתאמה אישית וניתנות לפרשנות בקלות של רגישות כימית בין מינים.

Abstract

הכלי של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה”ב לחיזוי רגישות בין מינים (SeqAPASS) הוא יישום סינון מקוון מהיר, זמין באופן חופשי, המאפשר לחוקרים ולרגולטורים לבצע אקסטרפולציה של מידע על רעילות בין מינים. עבור מטרות ביולוגיות במערכות מודל כגון תאים אנושיים, עכברים, חולדות ודגי זברה, נתוני רעילות זמינים עבור מגוון כימיקלים. באמצעות הערכה של שימור מטרות חלבונים, ניתן להשתמש בכלי זה כדי לבצע אקסטרפולציה של נתונים המופקים ממערכות מודל כאלה לאלפי מינים אחרים חסרי נתוני רעילות, מה שמניב תחזיות של רגישות כימית פנימית יחסית. המהדורות האחרונות של הכלי (גרסאות 2.0-6.1) שילבו תכונות חדשות המאפשרות סינתזה, פרשנות ושימוש מהירים בנתונים לפרסום בתוספת גרפיקה באיכות מצגת.

בין תכונות אלה ניתן למצוא תצוגות חזותיות של נתונים הניתנות להתאמה אישית ודוח סיכום מקיף שנועד לסכם נתוני SeqAPASS כדי להקל על הפרשנות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול להנחיית משתמשים בהגשת עבודות, ניווט ברמות השונות של השוואות רצפי חלבונים ופירוש והצגה של הנתונים המתקבלים. תכונות חדשות של SeqAPASS v2.0-6.0 מודגשות. יתר על כן, מתוארים שני מקרי שימוש המתמקדים בשימור חלבון טרנסתירטין וקולטן אופיואידים באמצעות כלי זה. לבסוף, נקודות החוזק והמגבלות של SeqAPASS נדונות כדי להגדיר את תחום הישימות של הכלי ולהדגיש יישומים שונים לאקסטרפולציה בין מינים.

Introduction

באופן מסורתי, תחום הטוקסיקולוגיה הסתמך במידה רבה על השימוש בניסויים בבעלי חיים שלמים כדי לספק את הנתונים הדרושים להערכות בטיחות כימיות. שיטות כאלה הן בדרך כלל יקרות ועתירות משאבים. עם זאת, בשל המספר הרב של כימיקלים המשמשים כיום והקצב המהיר שבו מתפתחים כימיקלים חדשים, ברחבי העולם יש צורך מוכר בשיטות יעילות יותר של סינון כימי 1,2. הצורך הזה ושינוי הפרדיגמה שנוצר כתוצאה מכך מניסויים בבעלי חיים הובילו לפיתוח שיטות גישה חדשות רבות, כולל מבחני סינון בתפוקה גבוהה, תמלול בתפוקה גבוהה, ריצוף מהדור הבא ומידול חישובי, שהם אסטרטגיות ניסוי חלופיותמבטיחות 3,4.

הערכת הבטיחות הכימית במגוון המינים שעלולים להיות מושפעים מחשיפה לכימיקלים הייתה אתגר מתמשך, לא רק עם בדיקות רעילות מסורתיות אלא גם עם שיטות גישה חדשות. ההתקדמות בטוקסיקולוגיה השוואתית וחזויה סיפקה מסגרות להבנת הרגישות היחסית של מינים שונים, וההתקדמות הטכנולוגית בשיטות חישוביות ממשיכה להגביר את תחולתן של שיטות אלה. מספר אסטרטגיות נדונו בעשור האחרון הממנפות מסדי נתונים קיימים של רצפי גנים וחלבונים, יחד עם ידע על מטרות מולקולריות כימיות ספציפיות, כדי לתמוך בגישות ניבוי לאקסטרפולציה בין מינים ולשפר את הערכות הבטיחות הכימיות מעבר לאורגניזמי המודל הטיפוסיים 5,6,7,8.

כדי לקדם את המדע לפעולה, להתבסס על מחקרים בסיסיים אלה בטוקסיקולוגיה מנבאת, לתעדף מאמצי בדיקה כימית ולתמוך בקבלת החלטות, נוצר הכלי “יישור רצף” של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה”ב לחיזוי רגישות בין מינים (SeqAPASS). כלי זה הוא יישום מבוסס אינטרנט ציבורי וזמין באופן חופשי המשתמש במאגרים ציבוריים של מידע על רצף חלבונים המתרחב ללא הרף כדי לחזות רגישות כימית על פני מגוון המינים9. בהתבסס על העיקרון שניתן לקבוע את הרגישות הפנימית היחסית של מין מסוים לכימיקל מסוים על ידי הערכת השימור של מטרות החלבון הידועות של אותו כימיקל, כלי זה משווה במהירות רצפי חומצות אמינו של חלבון ממין עם רגישות ידועה לכל המינים עם נתוני רצף חלבונים קיימים. הערכה זו הושלמה באמצעות שלוש רמות של ניתוח, כולל (1) רצף חומצות אמינו ראשוניות, (2) תחום תפקודי, ו-(3) השוואות של שאריות חומצות אמינו קריטיות, שכל אחת מהן דורשת ידע מעמיק יותר באינטראקציה הכימית בין החלבון ומספקת רזולוציה טקסונומית גדולה יותר בחיזוי הרגישות. נקודת החוזק העיקרית של SeqAPASS היא שמשתמשים יכולים להתאים אישית ולחדד את ההערכה שלהם על ידי הוספת שורות נוספות של ראיות לשימור מטרות בהתבסס על כמות המידע הזמין לגבי האינטראקציה הכימית או החלבון-חלבון המעניינת.

הגרסה הראשונה שוחררה בשנת 2016, אשר אפשרה למשתמשים להעריך רצפי חומצות אמינו ראשוניות ותחומים פונקציונליים באופן יעיל לחיזוי רגישות כימית והכילה יכולות הדמיה מינימליות של נתונים (טבלה 1). הבדלים בין חומצות אמינו בודדות הוכחו כגורמים חשובים להבדלים בין מינים שונים באינטראקציות בין כימיקלים לחלבונים, שיכולים להשפיע על הרגישות הכימית של מינים10,11,12. לכן, גרסאות מאוחרות יותר פותחו כדי לשקול את חומצות האמינו הקריטיות החשובות לאינטראקציה כימית ישירה13. בתגובה למשוב של בעלי עניין ומשתמשים, כלי זה עבר מהדורות גרסה שנתיות עם תכונות חדשות נוספות שנועדו לענות על הצרכים של חוקרים וקהילות רגולטוריות להתמודדות עם אתגרים באקסטרפולציה בין מינים (טבלה 1). ההשקה של SeqAPASS גירסה 5.0 בשנת 2020 הביאה תכונות ממוקדות משתמש המשלבות אפשרויות תצוגה חזותית של נתונים וסינתזת נתונים, קישורים חיצוניים, אפשרויות טבלת סיכום ודוח ותכונות גרפיות. בסך הכל, התכונות והיכולות החדשות של גרסה זו שיפרו את סינתזת הנתונים, את יכולת הפעולה ההדדית בין מסדי נתונים חיצוניים ואת הקלות של פרשנות נתונים לחיזוי רגישות בין מינים.

Protocol

1. תחילת העבודה הערה: הפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בכלי השירות ובתכונות העיקריות. תיאורים מפורטים של שיטות, תכונות ורכיבים ניתן למצוא באתר במדריך מקיף למשתמש (טבלה 1). טבלה 1: האבולוציה של הכלי SeqAPASS. רשימה של תכונות ועדכונים שנוספו לכלי Seq…

Representative Results

כדי להדגים את היישום של הכלי SeqAPASS ולהדגיש תכונות חדשות, מתוארים שני מקרי בוחן המייצגים מקרים שבהם שימור חלבונים מנבא כי ישנם הבדלים ברגישות הכימית בין מינים (טרנסתירטין אנושי) וכי אין הבדלים (μ קולטן אופיואידי [MOR]). הראשונה שבהן עוסקת ברצף חלבונים/השוואות מבניות כדי לחזות את תחום הישימות ש?…

Discussion

קיימת הכרה נרחבת בכך שלא ניתן לבחון באופן אמפירי מספיק מינים כדי ללכוד את המגוון הגנומי, הפנוטיפי, הפיזיולוגי וההתנהגותי של אורגניזמים חיים שעשויים להיות חשופים לכימיקלים בעלי עניין טוקסיקולוגי. המטרה של SeqAPASS היא למקסם את השימוש ברצף חלבונים קיים ומתרחב ללא הרף ובנתונים מבניים כדי לסייע…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר דניאל ל. וילנב (EPA ארה”ב, המרכז לטוקסיקולוגיה חישובית וחשיפה) ולד”ר ג’ון א. דורינג (המחלקה למדעי הסביבה, אוניברסיטת לואיזיאנה) על מתן הערות על טיוטה מוקדמת יותר של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית. הדעות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את ההשקפות או המדיניות של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה”ב, וגם אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מעיד על תמיכה של הממשל הפדרלי.

Materials

Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor’s highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A., Richardson, S. J., Cody, V. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. , 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths – United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018)
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021)
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021)

Play Video

Cite This Article
Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

View Video