Demonstrasjon av sekvensjusteringen for å forutsi på tvers av arter følsomhetsverktøy for rask vurdering av proteinbevaring

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å bruke den nyeste versjonen av US Environmental Protection Agency Sequence Alignment for å forutsi på tvers av arterfølsomhet (SeqAPASS) verktøy. Denne protokollen demonstrerer anvendelsen av det elektroniske verktøyet for raskt å analysere proteinbesparelse og gi tilpassbare og lett tolkbare spådommer om kjemisk følsomhet på tvers av arter.

Abstract

Det amerikanske miljøvernbyrået Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) -verktøyet er et raskt, fritt tilgjengelig, online screeningsprogram som gjør det mulig for forskere og regulatorer å ekstrapolere giftighetsinformasjon på tvers av arter. For biologiske mål i modellsystemer som humane celler, mus, rotter og sebrafisk, er toksisitetsdata tilgjengelig for en rekke kjemikalier. Gjennom evaluering av proteinmålbevaring kan dette verktøyet brukes til å ekstrapolere data generert fra slike modellsystemer til tusenvis av andre arter som mangler toksisitetsdata, noe som gir spådommer om relativ iboende kjemisk følsomhet. De nyeste utgivelsene av verktøyet (versjon 2.0-6.1) har innarbeidet nye funksjoner som muliggjør rask syntese, tolkning og bruk av dataene for publisering pluss grafikk i presentasjonskvalitet.

Blant disse funksjonene er tilpassbare datavisualiseringer og en omfattende sammendragsrapport designet for å oppsummere SeqAPASS-data for enkel tolkning. Dette papiret beskriver protokollen for å veilede brukere gjennom å sende inn jobber, navigere i de ulike nivåene av proteinsekvenssammenligninger og tolke og vise de resulterende dataene. Nye funksjoner i SeqAPASS v2.0-6.0 er uthevet. Videre beskrives to brukstilfeller fokusert på transtyretin og opioidreseptorproteinbevaring ved hjelp av dette verktøyet. Til slutt diskuteres SeqAPASS’ styrker og begrensninger for å definere anvendelsesområdet for verktøyet og fremheve ulike anvendelser for ekstrapolering på tvers av arter.

Introduction

Tradisjonelt har toksikologifeltet stolt sterkt på bruk av hele dyreforsøk for å gi de dataene som er nødvendige for kjemiske sikkerhetsevalueringer. Slike metoder er typisk kostbare og ressurskrevende. På grunn av det store antallet kjemikalier som brukes i dag og det raske tempoet som nye kjemikalier utvikles i, er det imidlertid globalt et anerkjent behov for mer effektive metoder for kjemisk screening ^1,2. Dette behovet og det resulterende paradigmeskiftet bort fra dyreforsøk har ført til utvikling av mange nye tilnærmingsmetoder, inkludert screeninganalyser med høy gjennomstrømning, transkripsjon med høy gjennomstrømning, neste generasjons sekvensering og beregningsmodellering, som lover alternative teststrategier ^3,4.

Evaluering av kjemisk sikkerhet på tvers av mangfoldet av arter som potensielt påvirkes av kjemiske eksponeringer, har vært en varig utfordring, ikke bare med tradisjonell toksisitetstesting, men også med nye tilnærmingsmetoder. Fremskritt i komparativ og prediktiv toksikologi har gitt rammer for å forstå den relative følsomheten til forskjellige arter, og teknologiske fremskritt innen beregningsmetoder fortsetter å øke anvendeligheten av disse metodene. Flere strategier har blitt diskutert i løpet av det siste tiåret som utnytter eksisterende gen- og proteinsekvensdatabaser, sammen med kunnskap om spesifikke kjemiske molekylære mål, for å støtte prediktive tilnærminger for ekstrapolering på tvers av arter og forbedre kjemiske sikkerhetsevalueringer utover de typiske modellorganismene 5,6,7,8.

For å fremme vitenskapen til handling, bygge videre på disse grunnleggende studiene i prediktiv toksikologi, prioritere kjemisk testinnsats og støtte beslutningstaking, ble US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) verktøyet opprettet. Dette verktøyet er en offentlig og fritt tilgjengelig nettbasert applikasjon som bruker offentlige lagre av stadig voksende proteinsekvensinformasjon for å forutsi kjemisk følsomhet på tvers av mangfoldet av arter⁹. Basert på prinsippet om at en arts relative iboende følsomhet for et bestemt kjemikalie kan bestemmes ved å evaluere bevaringen av de kjente proteinmålene for kjemikaliet, sammenligner dette verktøyet raskt proteinaminosyresekvenser fra en art med kjent følsomhet for alle arter med eksisterende proteinsekvensdata. Denne evalueringen fullføres gjennom tre analysenivåer, inkludert (1) primær aminosyresekvens, (2) funksjonelt domene og (3) kritiske aminosyrerestsammenligninger, som hver krever mer inngående kunnskap om kjemisk-proteininteraksjonen og gir større taksonomisk oppløsning i følsomhetsprediksjonen. En stor styrke ved SeqAPASS er at brukerne kan tilpasse og avgrense evalueringen ved å legge til flere bevislinjer mot målbevaring basert på hvor mye informasjon som er tilgjengelig om kjemisk protein eller protein-protein-interaksjon av interesse.

Den første versjonen ble utgitt i 2016, som tillot brukere å evaluere primære aminosyresekvenser og funksjonelle domener på en strømlinjeformet måte for å forutsi kjemisk følsomhet og inneholdt minimal datavisualiseringskapasitet (tabell 1). Individuelle aminosyreforskjeller har vist seg å være viktige determinanter for forskjeller på tvers av arter i kjemiske proteininteraksjoner, noe som kan påvirke artens kjemiske følsomhet^10,11,12. Derfor ble etterfølgende versjoner utviklet for å vurdere de kritiske aminosyrene som er viktige for direkte kjemisk interaksjon¹³. Som svar på tilbakemeldinger fra interessenter og brukere har dette verktøyet gjennomgått årlige versjonsutgivelser med flere nye funksjoner designet for å møte behovene til både forskere og reguleringsmiljøer for å takle utfordringer i ekstrapolering på tvers av arter (tabell 1). Lanseringen av SeqAPASS versjon 5.0 i 2020 brakte frem brukersentrerte funksjoner som inkluderer datavisualisering og datasyntesealternativer, eksterne lenker, sammendragstabell og rapportalternativer og grafiske funksjoner. Samlet sett forbedret de nye egenskapene og egenskapene til denne versjonen datasyntese, interoperabilitet blant eksterne databaser og enkel datatolkning for spådommer om følsomhet på tvers av arter.

Protocol

1. Komme i gang MERK: Protokollen som presenteres her er fokusert på verktøyverktøy og nøkkelfunksjoner. Detaljerte beskrivelser av metoder, funksjoner og komponenter finnes på nettstedet i en omfattende brukerhåndbok (tabell 1). Tabell 1: Utviklingen av SeqAPASS-verktøyet. En liste over funksjoner og oppdateringer som ble lagt til SeqAPASS-verktøyet fra den første distribusjonen. Forkortelser: SeqAPASS = sek…

Representative Results

For å demonstrere anvendelsen av SeqAPASS-verktøyet og fremheve nye funksjoner, beskrives to casestudier som representerer tilfeller der proteinbevaring forutsier at det er forskjeller i kjemisk følsomhet på tvers av arter (human transthyretin) og at det ikke er noen forskjeller (μ opioidreseptor [MOR]). Det første av disse eksemplene omhandler proteinsekvens / strukturelle sammenligninger for å forutsi anvendelsesområdet for uønskede utfallsveier (AOP, se tabell 2 for definisjon), mens det andr…

Discussion

Det er utbredt anerkjennelse at det ikke er mulig å empirisk teste nok arter til å fange genomisk, fenotypisk, fysiologisk og atferdsmessig mangfold av levende organismer som kan bli utsatt for kjemikalier av toksikologisk interesse. Målet med SeqAPASS er å maksimere bruken av eksisterende og kontinuerlig voksende proteinsekvens og strukturelle data for å hjelpe og informere ekstrapolering av kjemiske toksisitetsdata / kunnskap fra testede organismer til hundrevis eller tusenvis av andre arter gjennom sammenligninge…

Materials

Spreadsheet program	N/A	N/A	Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access	N/A	N/A	SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.