ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.
Abstract
פיגומים ביולוגיים שונים פותחו כדי להנחות הידבקות ושגשוג של תאים בתקווה לקדם פונקציות ספציפיות לשימושים במבחנה וב-in vivo . התוספת של גורמי גדילה לתוך פיגומים ביו-חומריים אלה נעשית בדרך כלל כדי לספק סביבת תרבית תאים אופטימלית, המתווכת את התמיינות התא ואת הפונקציות הבאות שלה. עם זאת, גורמי הגדילה בפיגום ביו-חומרי קונבנציונלי מתוכננים בדרך כלל להשתחרר עם ההשתלה, מה שעלול לגרום לתופעות לוואי לא מכוונות על הרקמות או התאים הסובבים אותם. כאן, ננו-מטריצת הבסיס של Janus בהשראת הדנ”א (JBNm) השיגה בהצלחה מיקרו-סביבה מקומית ביותר עם מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמות סחוס בנות קיימא. JBNms מורכבים בעצמם מננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3, וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) באמצעות ביו-אפיניות. ה-JBNm הורכב ביחס TGF-β1:matrilin-3:JBNt של 1:4:10, שכן זה היה היחס שנקבע שבו הרכבה נכונה למבנה שכבה אחר שכבה יכולה להתרחש. ראשית, הפתרון TGF-β1 נוסף לפתרון matrilin-3. לאחר מכן, תערובת זו היתה pipetted מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניות מספקת לפני תוספת של פתרון JBNt. זה יצר את JBNm שכבה אחר שכבה, לאחר פיפטינג מספר פעמים שוב. מגוון ניסויים נערכו כדי לאפיין את מבנה JBNm שכבה אחר שכבה, JBNts לבדו, מטרילין-3 לבדו ו-TGF-β1 לבדו. היווצרות JBNm נחקרה עם ספקטרום קליטת UV-Vis, ומבנה ה- JBNm נצפה במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). כאשר פיגומי JBNm החדשניים שכבה אחר שכבה נוצרים בקנה מידה מולקולרי, ניתן היה לצפות ב- JBNm המסומן בצבע פלואורסצנטי. ה- TGF-β1 מוגבל בתוך השכבה הפנימית של ה- JBNm הניתן להזרקה, מה שיכול למנוע שחרור של גורמי גדילה לאזורים הסמוכים, לקדם כונדרוגנזה מקומית ולקדם מיקרו-סביבה אנטי-היפרטרופית.
Introduction
פיגומים בהנדסת רקמות ממלאים תפקיד חיוני במתן תמיכה מבנית לחיבור תאים ולהתפתחות רקמות לאחר מכן1. בדרך כלל, מבני רקמה קונבנציונליים ללא פיגומים מסתמכים על סביבת תרבית התאים ומוסיפים גורמי גדילה כדי לתווך התמיינות תאים. יתר על כן, תוספת זו של מולקולות ביו-אקטיביות לפיגומים היא לעתים קרובות הגישה המועדפת בהנחיית התמיינות תאים ותפקודם 2,3. פיגומים מסוימים יכולים לחקות את המיקרו-סביבה הביוכימית של רקמות מקומיות באופן עצמאי, בעוד שאחרים יכולים להשפיע ישירות על תפקודי התאים באמצעות גורמי גדילה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות באתגרים בבחירת פיגומים שיכולים להשפיע לטובה על הידבקות התאים, גדילתם והתמיינותם, תוך מתן תמיכה מבנית ויציבות אופטימלית לאורך תקופה ארוכהשל 4,5. המולקולות הביו-אקטיביות קשורות לעתים קרובות באופן רופף לפיגום, מה שמוביל לשחרור מהיר של חלבונים אלה בעת ההשתלה, וכתוצאה מכך לשחרורן במקומות לא רצויים. זה מגיע לשיאו בתופעות לוואי על רקמות או תאים שלא הותקפו בכוונה 6,7.
פיגומים עשויים בדרך כלל מחומרים פולימריים. ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) היא פלטפורמת פיגומים ביומימטיים שנוצרה בשיטה חדשנית שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוסבת קיימא 8. ננו-צינוריות חדשניות אלה בהשראת דנ”א נקראו ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מכיוון שהן מחקות כראוי את המבנה ואת הכימיה של פני השטח של קולגן המצוי במטריצה החוץ-תאית (ECM). עם תוספת של מולקולות ביו-אקטיביות, כגון מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1), ה-JBNm יכול ליצור מיקרו-סביבה אופטימלית שיכולה לעורר את תפקוד התאים והרקמות הרצויים9.
JBNts הם ננו-צינוריות חדשניות שמקורן בגרסאות סינתטיות של הנוקלאובסיס אדנין והתימין. ה- JBNts נוצרים באמצעות הרכבה עצמית10; שישה נוקלאו בסיסים סינתטיים נקשרים ליצירת טבעת, וטבעות אלה עוברות אינטראקציות ערימה π-π ליצירת ננו-צינורית באורך 200-300 מיקרומטרבאורך 11. ננו-צינוריות אלה דומות מבחינה מבנית לחלבוני קולגן; על ידי חיקוי היבט של מיקרו-סביבה של סחוס מקומי, הוכח כי JBNts מספקים אתר התקשרות חיובי עבור כונדרוציטים ותאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)11,12,13,14. מכיוון שהננו-צינוריות עוברות הרכבה עצמית ואינן דורשות כל סוג של יוזם (כגון אור UV), הן מראות פוטנציאל מלהיב כפיגום הניתן להזרקה עבור אזורי פגם שקשה להגיע אליהם15.
מטרילין-3 הוא חלבון מטריצה חוץ-תאית מבנית המצוי בסחוס. חלבון זה ממלא תפקיד משמעותי בכונדרוגנזה ובתפקוד סחוס תקין16,17. לאחרונה, הוא נכלל בפיגומים ביו-חומריים, המעודדים כונדרוגנזה ללא היפרטרופיה 9,18,19. על ידי הכללת חלבון זה ב-JBNm, תאי הסחוס נמשכים לפיגום המכיל רכיבים דומים לאלה של המיקרו-סביבה המקורית שלו. בנוסף, הוכח כי מטרילין-3 נחוץ לאיתות תקין של TGF-β1 בתוך כונדרוציטים20. גורמי גדילה מתפקדים כמולקולות איתות, וגורמים לצמיחה ספציפית של תא או רקמה מסוימים. לכן, כדי להשיג התחדשות סחוס אופטימלית, matrilin-3 ו- TGF-β1 הם מרכיבים חיוניים בתוך JBNm. הוספת TGF-β1 לפיגום שכבה אחר שכבה יכולה לקדם עוד יותר את התחדשות הסחוס במבנה הרקמה. TGF-β1 הוא גורם גדילה המשמש לעידוד תהליך הריפוי של פגמים אוסטאוכונדרליים, המעודד התפשטות כונדרוציטים ו-hMSC והתמיינות21,22. לפיכך, TGF-β1 ממלא תפקיד מפתח בהתחדשות הסחוס JBNm (J/T/M JBNm)23, ומעודד צמיחה נכונה במיוחד כאשר הוא מקומי בתוך שכבות JBNm.
כאמור, גורמי גדילה מורכבים בדרך כלל על החלק החיצוני של פיגומים ללא שיטות התאגדות ספציפיות. כאן, עם הננו-ארכיטקטורה המתוכננת במדויק של הביו-חומרים, פותח ה-JBNm למיקוד ספציפי של תאים ורקמות מיועדים. ה-JBNm מורכב מ-TGF-β1 המודבק על משטחי JBNt בשכבה הפנימית ומטרילין-3 המודבק על משטחי JBNt בשכבה החיצונית24,25. השילוב של TGF-β1 בשכבה הפנימית של מבנה שכבה אחר שכבה מאפשר מיקרו-סביבה מקומית מאוד לאורך סיבי JBNm, ויוצר מבנה רקמה הומאוסטטי עם שחרור איטי בהרבה של החלבון12. יכולת ההזרקה של ה-JBNm הופכת אותו למבנה רקמת סחוס אידיאלי עבור יישומים ביו-חומריים עתידיים שונים26.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת מחקר זה היא לפתח פלטפורמת פיגומים ביומימטיים, JBNm, כדי להתגבר על המגבלות של מבני רקמה קונבנציונליים המסתמכים על סביבות תרביות תאים כדי לתווך התמיינות תאים. ה- JBNm הוא פיגום מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוס בת קיימא. העיצוב החדשני מבוסס על ננו-חומרים חדשניים בהשראת דנ”א, ה-JBNts. ה-JBNm, המור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH 7R01AR072027 ו- 7R03AR069383, פרס הקריירה של NSF 1905785, NSF 2025362 ואוניברסיטת קונטיקט. עבודה זו נתמכת בחלקה גם על ידי מענק NIH S10OD016435.
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
References
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
- Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
- Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
- James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
- Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
- Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
- Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
- Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
- Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
- Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
- Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
- Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
- Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
- Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
- Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
- Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
- Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
- Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
- Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
- Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
- Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
- Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
- Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
- Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
- Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
- Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
- Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
- Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
- Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
- Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).
