कार्टिलेज पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए परत-दर-परत जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स का निर्माण और लक्षण वर्णन
Summary
यह प्रोटोकॉल क्रमिक रूप से जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटीएस), मैट्रिलिन -3, और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-1) को जोड़कर परत-दर-परत जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) मचान की असेंबली का वर्णन करता है। जेबीएनएम को गढ़ा और विशेषता दी गई थी; इसके अतिरिक्त, इसने उत्कृष्ट बायोएक्टिविटी प्रदर्शित की, जो आसंजन, प्रसार और भेदभाव जैसे सेल कार्यों को प्रोत्साहित करती है।
Abstract
इन विट्रो और विवो उपयोगों के लिए विशिष्ट कार्यों को बढ़ावा देने की उम्मीद में सेल आसंजन और प्रसार का मार्गदर्शन करने के लिए विभिन्न बायोमटेरियल स्काफोल्ड्स विकसित किए गए हैं। इन बायोमटेरियल मचानों में विकास कारकों को जोड़ना आम तौर पर एक इष्टतम सेल संस्कृति वातावरण प्रदान करने, सेल भेदभाव और इसके बाद के कार्यों की मध्यस्थता करने के लिए किया जाता है। हालांकि, एक पारंपरिक बायोमटेरियल पाड़ में विकास कारक आमतौर पर आरोपण पर जारी करने के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप आसपास के ऊतक या कोशिकाओं पर अनपेक्षित दुष्प्रभाव हो सकते हैं। यहां, डीएनए-प्रेरित जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) ने स्व-टिकाऊ उपास्थि ऊतक निर्माण के लिए परत-दर-परत संरचना के साथ एक अत्यधिक स्थानीयकृत माइक्रोएन्वायरमेंट सफलतापूर्वक हासिल किया है। जेबीएनएम को जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटीएस), मैट्रिलिन -3, और बायोफिनिटी के माध्यम से ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-ए 1) से स्व-इकट्ठा किया जाता है। जेबीएनएम को 1: 4: 10 के टीजीएफ-ए1: मैट्रिलिन -3: जेबीएनटी अनुपात में इकट्ठा किया गया था, क्योंकि यह निर्धारित अनुपात है जिस पर परत-दर-परत संरचना में उचित असेंबली हो सकती है। सबसे पहले, टीजीएफ-ए 1 समाधान को मैट्रिलिन -3 समाधान में जोड़ा गया था। फिर, जेबीएनटी समाधान को जोड़ने से पहले पर्याप्त एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए इस मिश्रण को कई बार पाइप किया गया था। इसने कई बार फिर से पाइपिंग के बाद परत-दर-परत जेबीएनएम का गठन किया। परत-दर-परत जेबीएनएम संरचना, अकेले जेबीएनटीएस, अकेले मैट्रिलिन -3, और अकेले टीजीएफ-ए 1 को चिह्नित करने के लिए विभिन्न प्रकार के प्रयोग किए गए थे। जेबीएनएम के गठन का अध्ययन यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा के साथ किया गया था, और जेबीएनएम की संरचना को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ देखा गया था। चूंकि आणविक पैमाने पर अभिनव परत-दर-परत जेबीएनएम पाड़ का गठन किया जाता है, फ्लोरोसेंट डाई-लेबल जेबीएनएम देखा जा सकता है। टीजीएफ-ए1 इंजेक्शन योग्य जेबीएनएम की आंतरिक परत के भीतर सीमित है, जो आसपास के क्षेत्रों में विकास कारकों की रिहाई को रोक सकता है, स्थानीयकृत चोंड्रोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है, और एक एंटी-हाइपरट्रॉफिक माइक्रोएन्वायरमेंट को बढ़ावा दे सकता है।
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग में मचान सेल लगाव और बाद के ऊतक विकास के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। आमतौर पर, किसी भी मचान के बिना पारंपरिक ऊतक निर्माण सेल संस्कृति वातावरण पर निर्भर करते हैं और सेल भेदभाव को मध्यस्थ करने के लिए विकास कारकों को जोड़ते हैं। इसके अलावा, मचानों में बायोएक्टिव अणुओं का यह जोड़ अक्सर सेल भेदभाव और कार्य 2,3 का मार्गदर्शन करने में पसंदीदा दृष्टिकोण है। कुछ मचान स्वतंत्र रूप से देशी ऊतकों के जैव रासायनिक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कर सकते हैं, जबकि अन्य सीधे विकास कारकों के माध्यम से सेल कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, शोधकर्ताओं को अक्सर मचानों का चयन करने में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जो सेल आसंजन, विकास और भेदभाव को सकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जबकि लंबी अवधिमें इष्टतम संरचनात्मक समर्थन और स्थिरता प्रदान करते हैं। बायोएक्टिव अणु अक्सर पाड़ से शिथिल रूप से बंधे होते हैं जिससे आरोपण पर इन प्रोटीनों की तेजी से रिहाई होती है, जिसके परिणामस्वरूप अवांछित स्थानों में उनकी रिहाई होती है। यह ऊतकों या कोशिकाओं पर दुष्प्रभावों में समाप्त होता है जिन्हें जानबूझकरलक्षित नहीं किया गया था 6,7।
मचान आमतौर पर बहुलक सामग्री से बने होते हैं। जेनस बेस नैनो-मैट्रिक्स (जेबीएनएम) एक बायोमिमेटिक पाड़ मंच है जिसे स्व-टिकाऊ उपास्थि ऊतक निर्माण के लिए एक नई परत-दर-परत विधि के साथ बनायागया है। इन नए डीएनए-प्रेरित नैनोट्यूब को जेनस बेस नैनोट्यूब (जेबीएनटी) नाम दिया गया है, क्योंकि वे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में पाए जाने वाले कोलेजन की संरचना और सतह रसायन विज्ञान की ठीक से नकल करते हैं। बायोएक्टिव अणुओं के अलावा, जैसे कि मैट्रिलिन -3 और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा -1 (टीजीएफ-ए 1), जेबीएनएम एक इष्टतम माइक्रोएन्वायरमेंट बना सकता है जो तब वांछित सेल और ऊतक कार्यक्षमता9 को उत्तेजित कर सकता है।
जेबीएनटी न्यूक्लियोबेस एडेनिन और थाइमिन के सिंथेटिक संस्करणों से प्राप्त नए नैनोट्यूब हैं। जेबीएनटीएस का गठन स्व-विधानसभा10 के माध्यम से किया जाता है; छह सिंथेटिक न्यूक्लियोबेस एक अंगूठी बनाने के लिए बंधते हैं, और ये छल्ले11 की लंबाई में 200-300 μm नैनोट्यूब बनाने के लिए π-π स्टैकिंग इंटरैक्शन से गुजरते हैं। ये नैनोट्यूब संरचनात्मक रूप से कोलेजन प्रोटीन के समान हैं; देशी उपास्थि माइक्रोएन्वायरमेंट के एक पहलू की नकल करके, जेबीएनटीएस को चोंड्रोसाइट्स और मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) 11,12,13,14 के लिए एक अनुकूल लगाव साइट प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। क्योंकि नैनोट्यूब स्व-असेंबली से गुजरते हैं और किसी भी प्रकार के आरंभकर्ता (जैसे यूवी-प्रकाश) की आवश्यकता नहीं होती है, वे कठिन-से-पहुंचदोष क्षेत्रों के लिए एक इंजेक्शन योग्य मचान के रूप में रोमांचक क्षमता दिखाते हैं।
मैट्रिलिन -3 एक संरचनात्मक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन है जो उपास्थि में पाया जाता है। यह प्रोटीन चोंड्रोजेनेसिस और उचित उपास्थि समारोह16,17 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल ही में, इसे बायोमटेरियल स्काफोल्ड्स में शामिल किया गया है, जो हाइपरट्रॉफी 9,18,19 के बिना चोंड्रोजेनेसिस को प्रोत्साहित करता है। जेबीएनएम में इस प्रोटीन को शामिल करके, उपास्थि कोशिकाओं को एक मचान की ओर आकर्षित किया जाता है जिसमें इसके मूल माइक्रोएन्वायरमेंट के समान घटक होते हैं। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया है कि चोंड्रोसाइट्स20 के भीतर उचित टीजीएफ -1 सिग्नलिंग के लिए मैट्रिलिन -3 की आवश्यकता होती है। विकास कारक सिग्नलिंग अणुओं के रूप में कार्य करते हैं, जिससे एक निश्चित कोशिका या ऊतक की विशिष्ट वृद्धि होती है। इस प्रकार, इष्टतम उपास्थि पुनर्जनन प्राप्त करने के लिए, मैट्रिलिन -3 और टीजीएफ -1 जेबीएनएम के भीतर आवश्यक घटक हैं। परत-दर-परत मचान में टीजीएफ-ए1 को जोड़ने से ऊतक निर्माण में उपास्थि पुनर्जनन को बढ़ावा मिल सकता है। टीजीएफ-ए1 एक विकास कारक है जो ओस्टियोकॉन्ड्रल दोषों की उपचार प्रक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए नियोजित है, चोंड्रोसाइट्स और एचएमएससी प्रसार और भेदभाव21,22 को प्रोत्साहित करता है। इस प्रकार, टीजीएफ-ए1 उपास्थि पुनर्जनन जेबीएनएम (जे / टी / एम जेबीएनएम) 23 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, विशेष रूप से जब यह जेबीएनएम परतों के भीतर स्थानीयकृत होता है तो उचित विकास को प्रोत्साहित करता है।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, विकास कारक आमतौर पर मचानों के बाहर इकट्ठे होते हैं जिनमें निगमन के कोई विशिष्ट तरीके नहीं होते हैं। यहां, बायोमैटेरियल्स के सटीक रूप से डिज़ाइन किए गए नैनो-आर्किटेक्चर के साथ, जेबीएनएम को इच्छित कोशिकाओं और ऊतकों के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए विकसित किया गया था। जेबीएनएम आंतरिक परत में जेबीएनटी सतहों पर टीजीएफ-ए 1 से बना है और बाहरी परत24,25 में जेबीएनटी सतहों पर मैट्रिलिन -3 का पालन किया गया है। परत-दर-परत संरचना की आंतरिक परत में टीजीएफ-ए1 का समावेश जेबीएनएम फाइबर के साथ एक अत्यधिक स्थानीयकृत माइक्रोएन्वायरमेंट की अनुमति देता है, जिससे प्रोटीन12 की बहुत धीमी रिहाई के साथ एक होमियोस्टैटिक ऊतक निर्माण होता है। जेबीएनएम की इंजेक्टेबिलिटी इसे भविष्य के विभिन्न बायोमटेरियल अनुप्रयोगों के लिए एक आदर्श उपास्थि ऊतक निर्माण बनातीहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन का लक्ष्य पारंपरिक ऊतक निर्माणों की सीमाओं को दूर करने के लिए एक बायोमिमेटिक पाड़ मंच, जेबीएनएम विकसित करना है जो सेल भेदभाव को मध्यस्थ करने के लिए सेल कल्चर वातावरण पर भरोसा करते हैं। जेबीए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच अनुदान 7R01AR072027 और 7R03AR069383, nsF कैरियर अवार्ड 1905785, NSF 2025362 और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है। यह काम एनआईएच अनुदान एस 10ओडी016435 द्वारा भी समर्थित है।
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
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