传统上,细胞培养是在平面底物上进行的,这些底物与 体内细胞的自然环境模仿较差。在这里,我们描述了一种生产具有生理学相关弯曲几何形状和微图案细胞外蛋白的细胞培养底物的方法,从而可以系统地研究这些细胞外线索的细胞传感。
细胞外基质是细胞功能的重要调节剂。存在于细胞微环境中的环境线索,如配体分布和组织几何形状,已越来越多地被证明在控制细胞表型和行为中起着关键作用。然而,这些环境线索及其对细胞的影响通常使用分离单个线索 的体外 平台单独研究,这种策略严重简化了多个线索的复杂 体内 情况。工程方法对于弥合这一差距特别有用,通过开发实验装置来捕获 体内 微环境的复杂性,同时保持 体外 系统的精确度和可操作性。
本研究重点介绍了一种将基于紫外线(UV)的蛋白质图案化和基于光刻的底物微细加工相结合的方法,它们共同实现了对多库环境中细胞行为的高通量研究。通过无掩模UV光图案化,可以在包含各种明确定义的几何线索的芯片上的三维(3D)细胞培养基质上创建复杂的粘性蛋白质分布。所提出的技术可用于由不同聚合物材料制成的培养基质,并与各种蛋白质的粘合图案区域相结合。通过这种方法,单细胞以及单层可以受到图案化基板呈现的几何线索和接触引导线索的组合。因此,使用芯片材料,蛋白质模式和细胞类型组合的系统研究可以为细胞对多库环境的反应提供基本见解。
在体内,细胞受到各种环境线索的影响,这些线索可能具有源自细胞外基质(ECM)的机械,物理和生化性质。已经确定许多环境线索在细胞行为的调节中起着至关重要的作用,例如增殖,分化和迁移1,2,3,4,5。研究最广泛的现象之一是接触引导,描述粘附介导的细胞沿着细胞外底物上存在的各向异性生化或地形模式排列6,7,8,9,10,11。除了指导细胞的排列外,接触引导线索还被证明会影响其他细胞特性,例如细胞迁移,细胞内蛋白质的组织,细胞形状和细胞命运12,13,14,15。此外,3D细胞环境的几何结构也因其对细胞行为的调节影响而受到认可16,17。在人体中,细胞暴露于一系列弯曲的几何形状,从微尺度胶原纤维,毛细血管和肾小球,到中尺度肺泡和动脉18,19。有趣的是,最近的体外研究表明,细胞可以感知和响应这种物理线索,从纳米到中尺度20,21,22,23。
迄今为止,大多数研究细胞对环境线索反应的研究主要是使用分离单个线索的实验装置进行的。虽然这种方法在理解环境线索的细胞传感背后的基本机制方面取得了巨大进展,但它很难概括同时呈现多个线索的体内环境。为了弥合这一差距,开发培养平台是有用的,这样就可以独立并同时控制多个环境线索。这一概念最近获得了越来越多的关注,其中结合了基体刚度和配体密度26,27,28,29,基底刚度和孔隙率30,基底刚度和3D微细孔体积31,表面形貌和接触引导线索32,33,34和具有中尺度曲率引导线索的纳米级接触引导线索23。然而,以受控和高通量的方式将接触式引导提示与各种3D几何形状相结合仍然具有挑战性。
该研究方案解决了这一挑战,并引入了一种创建细胞培养基质的方法,该方法具有ECM蛋白(接触引导线索)和底物曲率(几何线索)的图案化粘合区域受控组合。这种方法允许在仿生多库环境中以系统和高通量的方式解剖细胞反应。获得的知识可以帮助进一步了解复杂环境中的细胞行为,并可用于设计具有将细胞反应引导到所需结果的特性的指导性材料。
3D 蛋白质光图案化
在细胞培养材料上创建ECM蛋白的粘附区域(接触引导线索)可以使用各种技术完成,例如,通过深紫外(深紫外)图案化或微接触打印35,36。深紫外图案化利用通过聚合物材料上的掩膜投射的紫外光来降解细胞培养基质上特定位置的钝化聚合物。然后将图案化的基质与感兴趣的配体一起孵育,从而产生支持细胞附着和在预定义位置12,37,38上培养的粘合区域。引入蛋白质图案的另一种方法是通过微接触印刷,其中含有所需形状的弹性图章被涂覆所选的蛋白质并压在细胞培养基板上,从而转移蛋白质涂层,细胞可以粘附35,37,39,40.不幸的是,由于这两种技术都依赖于掩模制备和软光刻方法,因此实验既耗时又费力,并且在图案灵活性方面受到限制。此外,深紫外图案化和微接触打印都最适合平面材料,并且在技术上很难(如果不是不可能的话)在3D环境中图案化配体。
为了改进这些常规方法,Waterkotte等人将无掩模光刻、化学气相沉积和热成型相结合,以生成微图案化的3D聚合物基板41。然而,该技术依赖于使用可热成型的聚合物薄膜,并提供低蛋白质模式分辨率(7.5μm),而据报道细胞对小至0.1μm2,42的几何蛋白质模式做出反应。Sevcik等人描述了另一种有希望的方法,即在含有纳米和微米形图的基板上将纳米图案ECM配体43。使用微接触印刷,将ECM蛋白从聚二甲基硅氧烷(PDMS)邮票转移到热响应性聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAM)基板上。随后,pNIPAM网络的热响应特性允许它们将二维(2D)蛋白质图案转移到地形PDMS基板(10-100μm深沟)上,从而控制粘附位点在地形特征上的定位。然而,并非所有可能的微地形图都可以图案化,因为润湿性降低的问题使得图案化更深的地形基板变得更加困难。据报道,深宽长比为2.4的沟渠是成功将图案转移到地形基板43的最终极限。此外,由于需要微接触印刷,不同图案的灵活性和生成的图案的分辨率很差。
本文介绍了一种克服上述瓶颈的方法,并提供了一种灵活且高通量的方法来创建可用于细胞培养的多库底物(见 图1)。曲率范围为 ĸ = 1/2500 至 ĸ = 1/125 μm-1 的生理相关几何形状(圆柱体、圆顶、椭圆形和鞍座表面)在 PDMS 芯片中预先设计并微加工。随后,通过使用分辨率小至1.5 μm44的光图案技术,使用各种数字图案设计在3D几何形状之上创建接触引导线索。为此,PDMS芯片最初被钝化以防止细胞和蛋白质粘附;然后可以通过光引发剂4-苯甲酰基苄基三甲基氯化铵(PLPP)和紫外光暴露45的组合来除去该钝化层。数字掩模旨在指定紫外线照射的位置,从而指定去除钝化层的区域。蛋白质随后可以粘附在这些区域,从而实现细胞附着。由于图案化是使用数字(而不是物理)掩模执行的,因此可以快速创建各种图案,而无需设计和制造其他光掩模的麻烦和成本。此外,可以在底物上图案化各种ECM蛋白(例如I型胶原,明胶和纤连蛋白)。尽管该协议是使用由PDMS制成的细胞培养芯片进行的,但该原理可以应用于感兴趣的任何其他材料46。
如今,细胞行为通常在缺乏天然细胞微环境复杂性的扁平培养基质上进行研究。3D环境,如脚手架和水凝胶被用作替代品。虽然这些细胞培养环境提高了 体内 相关性,但细胞行为的系统研究和读出方法的可行性仍然具有挑战性。为了系统地研究代表性培养基质上的细胞行为,需要一致的多cue底物,允许微观读数。因此,在该协议中,我们描述了一种创建具有生理学相关几何形状和图案化ECM蛋白的多cue细胞培养基质的方法。在 体外 平台上结合组织几何形状和接触引导线索等环境线索的主要挑战主要是技术性质的。将接触引导线索(例如,软光刻、深紫外图案化和微接触印刷35,36)应用于细胞培养材料的常规方法已针对平面基材进行了优化。对3D细胞培养材料与接触引导线索相结合的需求突出了几个技术挑战,例如模式对齐,分辨率和灵活性差。为了克服这些挑战,可以使用高通量、无掩模、基于光的图案化方法45,49。在这里,光学显微镜可以精确地对准图案,分辨率达到微米的数量级(见 图6)。此外,数字掩模的使用使研究人员能够研究各种图案上的细胞行为,而无需制造劳动密集型物理掩模。
紫外光图案化方法可与由一系列材料48产生的各种3D几何形状(例如,圆柱体、鞍座、圆顶、凹坑)结合使用。本研究中使用的3D细胞培养基质由PDMS制成;但是,也可以使用其他材料。这可能需要不同的步骤来生产包含感兴趣特征的最终细胞培养基质。由于细胞已被证明对细胞培养材料的表面粗糙度敏感,因此创建具有光滑表面的细胞培养芯片非常重要,以便观察到的细胞的反应可以完全归因于3D几何形状和接触引导线索50,51。光学轮廓测量,扫描电子显微镜或原子力显微镜等测量方法可用于测量表面粗糙度。在制造细胞培养材料后,可以根据目标特征的特定尺寸选择基于一个或多个焦平面的图案化方法(见 图3)。通常,单个焦平面用于在大约50μm的Z范围内绘制区域。使用此经验法则,图案分辨率被证明是一致的(参见 图6)。然而,这种方法的缺点是,随着多个焦平面和图案的引入,图案化时间增加。在我们手中,使用多个焦平面,最大16 mm x 16 mm x 0.17 mm(X x Y x Z)的3D几何特征已成功以高图案质量进行图案化。
此外,值得一提的是,可与此协议结合使用的几何特征的高度(Z轴)是有限的。由于紫外光图案和许多蜂窝读数都依赖于显微镜设置,因此物镜的工作距离决定了特征的最大高度。在我们手中,高度超过300μm的几何形状仍然可以进行紫外光图案化,并且已经使用具有40倍物镜的共聚焦显微镜进行了读数。因此,可以使用所描述的方案进行从细胞内到细胞和组织鳞片的机械生物学研究。
需要考虑的另一个因素是在UV光图案化期间或之后样品干燥的风险49。这在使用3D几何形状时尤其重要,因为凸面经常暴露在细胞培养材料之外。如图 4所示,这可能导致在感兴趣的特征上形成蛋白质聚集体的不均匀模式。在蛋白质孵育后和细胞培养过程中清洗细胞培养芯片对于3D几何形状的正确涂层至关重要。因此,建议始终在细胞培养芯片的顶部保留少量的工作溶液(PBS,PLPP,蛋白质溶液,细胞培养基)。
到目前为止,几种蛋白质包衣(纤连蛋白,I型和IV型胶原蛋白,明胶,FNC)和细胞类型(人骨髓基质细胞,人肌成纤维细胞,人内皮细胞,人角质形成细胞和真皮成纤维细胞)已经与所述的光图案方法组合用于结构化细胞培养材料上。如之前的研究48所示,蛋白质孵育参数的优化是新细胞类型系统研究的关键。因此,在对新蛋白质或细胞进行新实验之前,建议测试一系列蛋白质浓度,孵育温度和孵育时间。通过在“正常”细胞培养条件下,将均匀的图案状平坦区域的初始粘附后的细胞形态与细胞形态进行比较,可以获得一组优化的实验参数。此外,每种细胞类型在接种后可能需要不同的时间才能在特定的多库环境中显示可识别的粘附形态(见 图5)。为此,在步骤8.4的洗涤过程中,优化每种细胞类型在图案化区域上显示接触事件所需的时间至关重要。例如,我们观察到,在线性模式上,人角质形成细胞在接种后的前30分钟内显示出细长的形态,而内皮细胞和真皮成纤维细胞需要数小时才能显示出粘附形态的变化。因此,蛋白质孵育(步骤7)和细胞接种(步骤8)所需的实验参数可能取决于所选择的蛋白质和细胞类型。
在3D几何体上应用接触引导线索的方法有助于更深入地了解复杂多库环境中的细胞行为。这可能包括对细胞内成分的研究,例如局灶性粘连和细胞核,也可以涉及使用所提出的方法在更大的细胞或组织尺度上进行的实验。最终,预计所获得的知识可用于组织工程应用的设计,其中复杂的细胞环境旨在将细胞行为引向预期的结果。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Nello Formisano博士(MERLN技术研究所启发的再生医学)提供人类原发性角质形成细胞。这项工作得到了切梅洛特研究所(项目BM3.02)的支持。欧洲研究理事会(拨款851960);以及教育,文化和科学部的重力计划024.003.013“材料驱动的再生”。作者要感谢Alveole的通信,帮助和故障排除。
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |