Avstamningssporing av induserbare fluorescerende merkede stamceller i den voksne musehjernen

Summary

Evnen til permanent å markere stamceller og deres avkom med en fluorofor ved hjelp av en induserbar transgen linjesporingsmuselinje muliggjør romlig og tidsmessig analyse av aktivering, proliferasjon, migrasjon og / eller differensiering in vivo. Avstamningssporing kan avsløre ny informasjon om avstamningsforpliktelse, respons på intervensjon (er) og multipotens.

Abstract

En telomerase revers transkriptase (Tert) lineage-tracing muselinje ble utviklet for å undersøke oppførselen og skjebnen til voksne vevstamceller, ved å krysse ‘Tet-On’ -systemet oTet-Cre-musen med en ny omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA) transgen knyttet til Tert-promotoren, som vi har demonstrert markerer en ny populasjon av voksne hjernestamceller. Her vil administrering av tetracyklinderivatet doksycyklin til mTert-rtTA::oTet-Cre mus uutslettelig markere en populasjon av celler som uttrykker et 4,4 kb fragment av promotorregionen av genet Tert. Når kombinert Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus vil uttrykke membran tdTomato (mTomato) inntil doksycyklin behandling induserer erstatning av mTomato uttrykk med membran EGFP (mGFP) i celler som også uttrykker Tert. Derfor, når disse trippeltransgene avstamningssporingsmusene mottar doksycyklin (“puls” -perioden der TERT-uttrykkende celler er merket), vil disse cellene bli uutslettelig merkede mGFP + -celler, som kan spores i en hvilken som helst ønskelig tid etter doxycyklinfjerning (“jakt” -perioden), selv om Tert-uttrykket senere går tapt. Hjerner blir deretter perfusjonsfaste og behandlet for immunfluorescens og andre nedstrømsapplikasjoner for å tolke endringer i stamcelleaktivering, proliferasjon, avstamningsforpliktelse, migrasjon til ulike hjernenisjer og differensiering til modne celletyper. Ved hjelp av dette systemet kan enhver rtTA-mus parres med oTet-Cre og en Rosa-reporter for å utføre doksycyklinininduserbare “pulsjakt” avstamningssporingseksperimenter ved hjelp av markører av stamceller.

Introduction

Verdien av en linjesporingsmuselinje
Analyse av stamceller in vivo kan være vanskelig siden mange analyser som undersøker slike celler bare fokuserer på å karakterisere disse cellene på tidspunktet for dyrets død, som representerer et terminalt øyeblikksbilde i tid. For bedre å forstå prosessene for proliferasjon, differensiering og migrasjon av stamfar, mellomliggende / overgangscelletyper og modne celler over tid, er det nødvendig med en langsgående analysetilnærming. Dette kan oppnås med avstamningssporingsstudier der stam-/stamceller merkes uutslettelig og kan følges i lengre tid etterpå¹.

I den voksne pattedyrhjernen ble prosessen med nevrogenese der voksenfødte nevroner opprettes fra stam- og stamceller først analysert via etikettretensjon med tymidin-H^{3 2,3,4} eller 5-bromo-2′-deoksyuridin (BrdU)^5,6,7,8 . I disse studiene ble proliferative celler merket med tyminanalogen, som ble inkorporert i cellenes DNA under replikasjon og celledeling / proliferasjon. Den merkede cellen, så vel som deres avkom, inneholdt derfor denne analogen, som deretter ble identifisert post mortem. Men mens tymidin-H³ og BrdU tillot merking av proliferative celler og deres avkom i hjernegrupper der stamceller var dårlig forstått, ble disse studiene hindret av ulempene ved disse verktøyene. Tymidin-H³ induserer cellesyklusarrest, apoptose og doseavhengig DNA-syntesehemming⁹, mens BrdU markerer celler i varierende nivåer avhengig av administrasjonsveien¹⁰ og tas opp av celler under reparasjon eller apoptose, samt under celledeling¹¹. Mer effektive merkingsmetoder har blitt brukt nylig, for eksempel merking med 5-ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU), men mange av de samme problemene som BrdU forblir fortsatt¹². Disse tilnærmingene er også begrensende ved at de markerer enhver proliferativ celle, ikke bare stamceller, og dermed kan tolkning av resultatene bli forvirret. I den nevrogene linjen beholder alle stam- og stamceller mitotisk kapasitet, og bare terminale / modne nevroner er ikke proliferative. For astrocytter og mikroglia, men ikke oligodendrocytter, opprettholdes proliferasjon på ubestemt tid 13,14,15.

Transgene mus som brukes til å avstamme spor bare celler som uttrykker et protein av interesse, for eksempel en bekreftet for å identifisere voksne stamceller som vi bruker her, har derfor blitt vanligere når man undersøker stamceller og deres avkom. Selv om det er vanskelig å generere gjennom musetransgene tilnærminger, tillater avstamningssporing av muselinjer sporing av spesifikt merkede celler i hjernen, og er ikke avhengig av spredning alene. I Tet-On-transgent musesystem induserer administrering av tetracyklin eller doksycyklin (et tetracyklinderivat) Cre-recombinase-ekspresjon i celler som er konstruert med en omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA), som transkriberes av en promotor av interesse. Den Tet-induserbare Cre-drevne rekombinasjonen vil da aktivere uttrykket av et uutslettelig fluorescerende eller luminescerende protein i cellene av interesse, avhengig av Rosa-reportermusen som brukes. Disse uutslettelig merkede cellene fortsetter å uttrykke denne reporteren etter deling, differensiering eller migrasjon, slik at sporing av disse cellene og deres avkom over tid eller etter forskjellige inngrep¹⁶. Fordeler med transgene avstamningssporingsmetoder inkluderer: 1) spesifisitet ved sporing til en bestemt cellelinje eller stamcelle /stamcelle markert med rtTA, 2) uutslettelig uttrykk for fluorescerende eller selvlysende protein til tross for celleomsetning eller differensiering, 3) lav toksisitet, 4) betinget aktivering under ethvert punkt i dyrets livssyklus, og 5) brukervennlighet med vanlige analyser, inkludert immunostaining/immunfluorescens¹⁶.

Andre metoder for tidsmessig induserbare reporterverktøy hos mus inkluderer bruk av Cre-ERT2 mus, som kan parres med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andre fluorescerende reportertransgener. I disse dyrene driver et cellespesifikt reguleringselement, for eksempel en promotor eller forsterkerregion av interesse, produksjonen av Cre recombinase, som bare kan aktiveres ved administrering av tamoxifen. Mens Cre-ERT2 muselinjer tillater induksjon av Cre i spesifikke cellelinjer, er det et vell av kunnskap som beskriver effekten av tamoxifen på voksen neurogenese^17,18. I tillegg eksisterer det mange ROSA-drevne fluorescerende reportergener som kan brukes i stedet for GFP eller mTmG, inkludert YFP eller CFP, noe som vil tillate alternativ fluorescerende merking i andre fluorescerende bølgelengder. Disse fluorescerende reportergenene kan brukes med Tet-On- eller Cre-ERT2-systemer.

Telomerase reverstranskriptase (TERT) er den hastighetsbegrensende komponenten i holoenzym telomerase, som arbeider for å utvide telomerer etter at de er forkortet under celledeling^19,20. TERT har blitt identifisert som en markør for voksne vevsstamceller i tarmen^21,22, benmarg²¹, lever²³, fett²⁴, endometrium^25,26 og bein 1. Hvorvidt TERT-uttrykk i disse voksne stamcellene utelukkende er for telomeraseforlengende aktivitet eller for å utføre ikke-kanoniske TERT-roller²⁷, er fortsatt ukjent. TERT-uttrykkende hvilende voksne stamceller (qASCs) har blitt identifisert og sporet gjennom hele kroppen med transgene avstamningssporingsmus for å studere multipotensen og selvfornyelsesevnen til disse stamcellene, samt deres potensial til å aktivere, spre, differensiere og migrere 1,22,23,28. Opprettelsen av Tert-rtTA-transgenet har blitt utført tidligere¹. I dette papiret vil vi beskrive bruken av en avstamningssporing TERT-muselinje for å studere TERT + qASCs som vi har identifisert som en ny ASC-populasjon i den voksne musehjernen.

Generering av en transgen avstamningssporingsmuselinje
For å generere en avstamningssporingsmuselinje ved hjelp av Tet-On-systemet, må tre transgener kombineres i et enkelt dyr gjennom museparring. Den første er en rtTA, uttrykt under kontroll av promotoren av genet av interesse (vår er TERT-rtTA). I en celle som uttrykker dette genet av interesse, vil rtTA derfor bli uttrykt. Det andre er et oTet-Cre-gen, som inneholder et tetracyklinresponselement (TRE) som vil tillate transkripsjon av Cre recombinase i nærvær av både et rtTA-fusjonstransskript og tetracyklin eller doksycyklin. Tetracyklin eller doksycyklin kan administreres til et dyr via drikkevann eller chow²⁹. Til slutt må det være et gen som vil bli aktivert av Cre recombinase cleavage. I dette manuskriptet er merkingsgenet vi vil beskrive Rosa26-mTmG-genet, som frem til Cre-rekombinasjon allestedsnærværende vil transkribere mTomato (membranrød fluorescens i alle celler). Men hvis en celle uttrykker rtTA-transkripsjonen og inneholder tetracyklin eller doksycyklin, vil Cre-rekombinasjon av et sett med lox P-steder mellom mTomato- og mGFP-stedene endre R26-stedet og føre til at cellen produserer membran EGFP (mGFP eller membrangrønn fluorescens) i stedet for membrantomat. Den uutslettelige naturen til dette mGFP-signalet vil tillate in vivo-merking og sporing av celler når de sprer seg, migrerer og differensierer. Etter sporet kan celler analyseres for ekspresjon av GFP via immunfluorescens i standard kryoseksjoner eller tykkere optisk ryddede hjerner.

I denne artikkelen vil vi beskrive bruken av den spesifikke muselinjen, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. For å lage denne trippel transgene muselinjen parret vi først oTet-Cre-dyr (Jackson Lab-stammen #006234) til Rosa-mTmG-dyr (Jackson Lab-stammen #007676) for å lage oTet-Cre::Rosa-mTmG dobbelttransgene mus. Disse dyrene ble genotypet med primere og PCR-maler angitt i tilleggstabell 1 og 2. mTert-rtTA mus (skapt av David Breault¹) ble parret med oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr for å lage mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus (Figur 1A)^1,30. Virkningsmekanismen til mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muselinjen er illustrert i figur 1B.

Doxycyklin-induksjon og pulsjaktdesign
Når du planlegger eksperimenter, er det viktig å vurdere flere faktorer som vil påvirke utfallet av avstamningssporingseksperimenter, inkludert dyrets alder ved doksycyklininduksjon, lengden på doksycyklinadministrasjon (“puls” -perioden), lengden på tiden etter fjerning av doksycyklin før vevsinnsamling (“jakt” -perioden) og tidspunktet for eventuelle inngrep under disse prosessene. Disse studiedesignhensynene er avgjørende for å forstå de merkede cellene og deres avkom ved avslutningen av eksperimentet. Det første trinnet i prosessen er å identifisere dyrets alder av interesse og lengden på doxycyklinadministrasjonen. Lengre pulsperioder vil gjøre det mulig for flere celler å uttrykke den rtTA-koblede promotoren å bli uttrykt og flere celler av interesse for å bli uutslettelig merket. En celletype som utviser forbigående uttrykk for genet av interesse, kan kreve en lengre pulsperiode enn celler som kontinuerlig uttrykker genet av interesse. Men hvis målet med studien er å forstå kortsiktige effekter av cellen av interesse eller et akutt inngrep, kan pulsperioden ikke være for lang, da når en celle er merket, vil den spores gjennom en rekke endringer i løpet av resten av pulsperioden. I noen av våre studier ble en 2 dagers puls uten jaktperiode brukt til å etterligne en direktereporter for TERT. Dette skyldes at minimumstiden for rekombinasjon av Rosa-mTmG-genet er 2 dager³¹.

Den neste viktige perioden i et pulsjakteksperiment er lengden mellom fjerning av doksycyklin og perfusjon av dyret, også kjent som “jakten”. Halveringstiden for doksysyklin hos mus er ca. 170 minutter uavhengig av administrasjonsvei, noe som gjør det mulig å konkludere med at doksysyklininduksjon sannsynligvis ikke lenger forekommer flere timer etter fjerning³². Det er imidlertid viktig å merke seg at doksysyklinmetabolismen er langsommere hos eldre mus, noe som kan føre til lengre effektive pulsperioder enn unge dyr³³.

I løpet av jaktperioden vil merkede celler fortsette å bli merket, selv etter spredning, differensiering eller migrasjon. Avkommet til disse cellene vil også bli merket. Målet med studien vil forme lengden på pulsjaktparadigmet. Hvis målet med studien er å forstå regenerering av et vev over lang tid med cellene av interesse, kan det være nødvendig med en lang jaktperiode. Til slutt må tidspunktet for eventuelle inngrep eller behandlinger avgjøres. Administrasjon i pulsperioden vil påvirke cellene som uttrykker genet av interesse, så vel som ethvert avkom opprettet i løpet av denne tiden, mens administrasjon i jaktperioden kan påvirke for det meste avkom av cellene av interesse, selv om dette vil avhenge av hvor raskt de merkede cellene deler seg eller differensierer. Eksempler på pulsjakt eksperimentelle design vi har benyttet er skissert i figur 2A.

Det er også viktig å være klar over muligheten for GFP-signal i bakgrunnen på grunn av lekkende uttrykk. Lekkende ekspresjon oppstår som et resultat av iboende bindingspotensial mellom rtTA og Otet-sekvensene i fravær av doksycyklin, og gjenværende aktivitet av Otet-transgenet i fravær av rtTA (gjennomgått i³⁴). Lekkende uttrykk representerer en svakhet ved Tet-systemene, og selv om lekkasjen ofte er en akseptabel ulempe for systemet, kan situasjoner der det lekkende uttrykket kan føre til toksisitet og dødelighet, for eksempel med diptheriatoksin (DTA) hos Otet-DTA-dyr begrense bruken av disse systemene³⁵.

Hjernebehandling, seksjonering og immunfluorescens av tynne seksjoner for mikroskopi
For å analysere hjernen til mus etter et avstamningssporingseksperiment, må mus først perfunderes via transkardial perfusjon for å fjerne blod og CSF som kan føre til høy autofluorescens i hjernen. Det er to vanlige fikseringsmidler som dyret kan perfunderes med: Histochoice Tissue Fixative, et glyoksalfiksativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoksale fikseringsmidler tillater en relativt skånsom fikseringsprosess med mindre kryssbinding enn PFA. Dette reduserer vevsstivhet, reduserer behovet for antigenuthenting, og muliggjør mindre konsentrerte antistoffløsninger under immunostaining. Men hvis de inneholder metanol, kan dette tjene til å øke autofluorescens³⁶. På den annen side vil PFA ofte tillate en mer robust fiksering, og mens antigenuthenting vil være nødvendig under immunostaining, er det antistoffer som bare vil fungere med PFA-faste vev, og perfusjon med 4% PFA er nødvendig for den optiske clearingteknikken beskrevet senere.

Følgende perfusjon er et postfikseringstrinn, hvor hjernen er nedsenket i samme type fikseringsmiddel som brukes under perfusjonen over natten. Dette gjør det mulig for alle hjernegrupper som kanskje ikke har blitt fullstendig løst under perfusjonen å fortsette å fikse. Deretter vil hjernen inkuberes i sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne så mye vann som mulig før frysetrinnet for å forhindre isdannelse i vevet (“kryobevaring”). Hjerner kan da kuttes i et hvilket som helst antall sagittale, koronale eller tverrgående vevsseksjoner for behandling. For både presisjon og reproduserbarhet må kalibrerte hjerneblokker brukes på en måte som sikrer konsistente bregma-kutt mellom dyr. Den viktigste faktoren som kan påvirke hvordan hjernen er seksjonert, er hjerneområdet (e) av interesse. For eksempel, mens et sagittalt kutt kan tillate at flere hjernegrupper analyseres i en vevsseksjon, vil dette kuttet ikke tillate analyse av nevro / gliogene regioner i den ventrikulære subventrikulære sonen (V-SVZ) da laterale og mediale sider av lateral ventrikel vil være umulig å skille i den dimensjonen og observeres bedre i koronalplanet. Dette kan være et viktig skille å gjøre i voksne nevrogenesestudier, da lateralsiden av lateral ventrikel inneholder den neurogene V-SVZ, mens medialveggen i lateral ventrikel er en mer gliogen nisje³⁷.

Etter at vev har blitt delt inn i koronale, sagittale eller tverrgående seksjoner, vil de bli frosset i blokker ved hjelp av optimal kjøletemperatur (OCT) innebyggingsløsning. Her fryses hjerner i dette materialet, med bruk av en blanding av tørris og etanol. Hvis tynn seksjonsanalyse er nødvendig, vil blokker bli skåret på en kryostat, og avhengig av nedstrømsanalysen som kreves, kan man følge positivt ladede glassglass som tynne seksjoner (<20 μm). Glassglass som ikke er ladet kan også brukes, men bruk av usladede lysbilder kan føre til at vev løsner fra lysbildene³⁸. Hvis det er behov for frittflytende vevsseksjoner med middels tykkelse (>20 μm), vil vev bli samlet som frittflytende seksjoner. Hvis tykke seksjoner (0,5-4 mm) er nødvendig, er det nødvendig å skjære ikke-frosne hjerneseksjoner med en vibratom. Det er viktig å merke seg lagringsforskjellene mellom seksjoner på lysbilder, som krever frysing ved -20 til -80 ° C og frittflytende seksjoner, som vil bli lagret ved 4 ° C.

Hjernerydding og heldekkende immunfluorescerende konfokalmikroskopi
Hvis en bredere, men mindre detaljert analyse av avstamningssporede celler i musehjernen er ønskelig, er en omfattende analyse av tykkere segmenter av hjernevev mulig med iDISCO hjernerydding³⁹ etterfulgt av immunostaining og flislagt z-stack konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi. Her vil store deler av musehjernen bli optisk ryddet (en prosess med delipidering³⁹), noe som bedre muliggjør fluorescerende signalavbildning over en 1 mm vevsseksjon. Ulempene med denne prosessen er høy autofluorescens og redusert evne til å oppnå høyoppløselige bilder av cellemorfologi og detaljert samfargingsanalyse på grunn av de økte arbeidsavstandene som kreves sammenlignet med mer tradisjonelle metoder (tynne kryoseksjoner eller frittflytende seksjoner). Av denne grunn anbefaler vi hjernerydding for å analysere de store avstamningssporingsresultatene gjennom flere hjerneområder, i stedet for å forsøke å karakterisere eller analysere individuelle celler.

Protocol

Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University. 1. Opprettelse av en avstamning som sporer Tet-On-muselinje, avlsstrategier og genotyping for eksperimentelle kohortmus MERK: Her skisserer vi opprettelsen av et Tet-On-musesystem med Rosa-mTmG som det fluorescerende reportergenet som gjennomgår Cre-rekombinasjon, men forskjellige andre Cre-rekombinasjonsdrevne reporterlinjer kan …

Representative Results

Mens fluorescerende signal som følge av et Tet-On-system med en fluorescerende reporter vil variere avhengig av promotoren av interesse og fluorofor (er) som brukes, vil vi beskrive hvordan funnene ble analysert med mTert-rtTA: : oTet-Cre: : Rosa-mTmG dyr. Analyse av voksne hjerner etter en pulsjakt resulterte i membran GFP-uttrykkende celler gjennom ulike anatomiske nisjer. Forskjellen i fluorescerende intensitet mellom ulike celletyper må noteres. En variabel angående fluorescerende intensitet er størrelsen på cel…

Discussion

En metode for opprettelse, utnyttelse og analyse av en trippel transgen linjesporing muselinje som markerer stamceller i den voksne musehjernen in vivo er beskrevet. Når det kombineres med immunostaining eller hjernerydding, kan identifisering og karakterisering av sporede fluorescerende celler over hele hjernen oppnås. Denne teknikken gir muligheten til å forstå plastikk / regenerativ / remodeling potensial av merkede stamceller som de aktiverer, migrere, differensiere, eller spre seg. Mens tidligere data o…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx