Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Summary

Nós descrevemos um ensaio qualitativo para a adesão e invasão de levedura ágar como uma medida de diferenciação invasivo e pseudohyphal. Este ensaio simples pode ser usado para avaliar o fenótipo invasivo de mutantes diversas, bem como as pistas efeitos ambientais e vias de sinalização na diferenciação de levedura.

Abstract

Leveduras são encontradas em biofilmes naturais, onde muitos microrganismos colonizam superfícies. Em ambientes artificiais, tais como superfícies de objetos feitos pelo homem, os biofilmes podem reduzir a produtividade industrial, destruir estruturas, e ameaçam a vida humana. 1-3 Por outro lado, aproveitando o poder de biofilmes pode ajudar a limpar o meio ambiente e geração de energia sustentável. 08/04 A capacidade de S. cerevisiae para colonizar superfícies e participar em biofilmes complexo foi ignorada na maior parte, até a redescoberta dos programas de diferenciação desencadeada por várias vias de sinalização e sugestões ambientais a este organismo. 9, 10 O interesse de continuar no uso de S. cerevisiae como organismo modelo para entender a interação e convergência das vias de sinalização, como o Ras-PKA, Kss1 MAPK e Hog1 vias de osmolaridade, rapidamente colocado S. cerevisiae na junção de biofilme biologia e da pesquisa de transdução de sinal. 20/11 Para este fim, a diferenciação de células de levedura em longas e adesivo, filamentos pseudohyphal tornou-se uma leitura conveniente para a ativação de vias de transdução de sinal em várias mudanças ambientais. No entanto, filamentação é uma coleção de fenótipos complexos, o que faz a dosagem para ele como se fosse um fenótipo simples enganosa. Na última década, vários ensaios foram adotados com sucesso a partir de estudos biofilme bacteriano para a pesquisa de leveduras, tais como ensaios MAT formação para medida de dispersão colônia em agar suave e coloração violeta cristal para medir quantitativamente a adesão da superfície celular. 12, 21 No entanto, tem havido alguma confusão em ensaios desenvolvidos para avaliar qualitativamente os fenótipos adesiva e invasiva de leveduras em ágar. Aqui, apresentamos um método simples e confiável para avaliar a qualidade adesiva e invasiva de cepas de leveduras com fácil de compreender as etapas para isolar a avaliação de adesão da avaliação invasão. Nosso método, adotado a partir de estudos anteriores, 10, 16 envolve células que crescem em meios líquidos e revestimento em condições diferenciais de nutrientes para o crescimento de grandes manchas, que em seguida, lave com água para avaliar a adesão e esfregar as células completamente fora da superfície do ágar para avaliar a invasão em o ágar. Nós eliminamos a necessidade de estrias células em ágar, o que afeta a invasão de células no agar. Em geral, observamos que as cepas haplóides que invadem agar são sempre cola, mas não todas as estirpes adesivo pode invadir o ágar. Nossa abordagem pode ser usada em conjunto com outros ensaios a dissecar cuidadosamente os passos e requisitos de diferenciação de transdução de sinal de levedura, diferenciação, quorum sensing, e formação de biofilme.

Protocol

Colocar 200ul de culturas de interesse crescente em placas sintéticas mídia com as condições necessárias a fome (SC com glicose 2% versus SC com glicose 0,2%, por exemplo) Se a densidade de culturas são muito diferentes um do outro, ajustar a contagem de células por cultura 200ul de modo que cada gota tem aproximadamente a mesma quantidade de células. Certifique-se manter registros de que queda nas placas é que a cultura. Mantenha a tampa entreaberta prato e deixe em temperatura ambiente ou a 30 ° C até g…

Discussion

Células de levedura mostrar modos diversos de diferenciação de acordo com a disponibilidade de nutrientes e condições ambientais, incluindo a formação de esporos sob condições de estresse de fome e, filamentação sob várias tensões de nutrientes e floculação. Diversas leveduras, incluindo S. cerevisiae e C. albicans, também podem ser encontradas em biofilmes formados por um conjunto diversificado de microorganismos. Embora haja alguma correlação com filamentação e comportamento invasivo, não está claro exatamente como f…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Moticam 350	Camera	Motic	discontinued (new model: Moticam 352)	A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.